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前言 間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cell, MSC）來源于發(fā)育早期的中胚層，具有多向分化潛能、造血支持和 促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起越來越多的關(guān)注。MSC可以從骨髓、脂 肪組織、滑膜、皮膚、牙髓以及胎兒附屬物如胎盤、臍帶血和臍帶中分離獲得1-3。盡管骨髓是最廣泛使用的 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的來源，但是骨髓穿刺的侵襲性再倫理上限制了其應(yīng)用方向的可行性，并且骨髓間充質(zhì)干 細(xì)胞的增殖分化能力普遍隨著供體年齡增加而下降。臍帶是優(yōu)質(zhì)的MSC的來源組織，臍帶來源的MSC具有增 殖能力、分化能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，并且其取材不涉及倫理問題，具有廣泛的應(yīng)用前景4-5. 康寧MSC Xeno-Free SFM間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基化學(xué)成分明確，不包含血清及其他任何人源以外成分， 使用方便，無需額外添加物，可支持不同來源（骨髓/脂肪/臍帶來源）間充質(zhì)干細(xì)胞多次傳代培養(yǎng)。
材料
臍帶組織
Corning® MSC Xeno-Free SFM間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基 (Corning, Cat. No. 88-600-CV)
Corning® CellBIND® 75cm² 細(xì)胞培養(yǎng)瓶 (Corning, Cat. No. 3290)
10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿 (Corning, Cat. No. 430293)
TrypLE™ Select Enzyme (ThermoFisher, Cat. No. 12563029)
磷酸鹽緩沖液PBS (Corning, Cat. No. 21-040-CV)
實(shí)驗(yàn)步驟
臍帶來源MSC的分離和培養(yǎng)
1.在生物安全柜中，將臍帶從50 mL離心管中取出轉(zhuǎn)移至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用無菌手術(shù)剪將臍帶盡可能 剪碎，臍帶碎片以不超過1 mm大小為佳。
注：臍帶來源MSC的分離和培養(yǎng)整個過程嚴(yán)格保持無菌狀態(tài)，否則可能因污染導(dǎo)致MSC細(xì)胞分離培養(yǎng) 失敗。
2.用無菌PBS漂洗臍帶組織塊2次，1,000 x g離心5分鐘，棄上清。
3.用10 mL康寧間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基重懸臍帶碎片，隨后將懸液轉(zhuǎn)移至CellBIND® 75cm² 細(xì)胞培養(yǎng) 瓶（T75）中，置于37℃，5%CO2 環(huán)境中培養(yǎng)。
注：康寧間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基使用時無需對培養(yǎng)表面進(jìn)行包被處理，但我們推薦使用CellBIND® 表面進(jìn)行培養(yǎng)，可以使MSC更好地貼壁。 可選擇添加5% human platelet lysate（HPL）可明顯加速MSC 細(xì)胞爬出與生長。
4.培養(yǎng)最初7天無需更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第7天時，顯微鏡下可觀察到臍帶碎片周圍出現(xiàn)貼壁單細(xì)胞，將 培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基。
5.繼續(xù)培養(yǎng)至第12天時，顯微鏡下觀察在臍帶碎片組織周圍出現(xiàn)MSC，更換一半培養(yǎng)基為新鮮培養(yǎng)基。
6.培養(yǎng)至第15天左右，MSC細(xì)胞融合度至約90%-100%，MSC細(xì)胞可進(jìn)行收獲或進(jìn)行傳代。
7.傳代后的MSC 細(xì)胞可直接用Corning MSC SFM 培養(yǎng)擴(kuò)增，無需加任何 HPL 或 血清替代物。 MSC的收獲、傳代和鑒定
8.預(yù)熱PBS, TrypLE™ Select Enzyme至室溫。
9.用PBS漂洗細(xì)胞表面2次，棄去PBS，加入TrypLE™ Select Enzyme 37℃孵育2-3 min。
10.當(dāng)細(xì)胞開始變圓并從培養(yǎng)瓶底部脫離，用移液管輕柔吹打成的單細(xì)胞懸液。
11.加入間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶，置于37℃，5%CO2 環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，每周更換2 次新鮮培養(yǎng)基。
12.MSC的鑒定可通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行，檢定標(biāo)準(zhǔn)為：CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166等
表達(dá)陽性（95%以上）；CD14、CD31、CD34、CD45等表達(dá)陰性（2%以內(nèi)）。
參考文獻(xiàn)
1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
4. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cellsderived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6),1384-1392 (2007).
5. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion,placenta, Wharton's jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
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