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引言
自然殺傷（NK）細(xì)胞在識(shí)別和殺死腫瘤和病毒感染的先天免疫和后天免疫反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵的角色。因此，已有許多研究嘗試研發(fā)在體外激活和擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，以用于和免疫細(xì)胞相關(guān)研究，而目前的方法包括使用細(xì)胞因子、誘導(dǎo)因子以及飼養(yǎng)細(xì)胞1，其中細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性中具有核心作用。據(jù)報(bào)道，IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IFN-γ被歸類(lèi)為NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性 和增殖的活化細(xì)胞因子，能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)各種腫瘤的細(xì)胞毒性作用2。然而，這些激活NK細(xì)胞的細(xì)胞因子組合仍需研究人員進(jìn)一步優(yōu)化。 康寧NK無(wú)血清培養(yǎng)試劑盒II中含有1瓶1 mL的包被培養(yǎng)基，1瓶50 mL的激活培養(yǎng)基，1瓶1,000 mL的擴(kuò)增培養(yǎng)基和1個(gè)透氣性細(xì)胞培養(yǎng)袋。前兩個(gè)試劑專(zhuān)用于NK細(xì)胞的初期激活培養(yǎng)，擴(kuò)增培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)袋則用于NK細(xì)胞后期擴(kuò)增培養(yǎng)。NK激活培養(yǎng)基和擴(kuò)增培養(yǎng)基均采用優(yōu)質(zhì)的試劑和符合目前的良好生產(chǎn)規(guī)范（cGMP）要求的原料制造。培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)是可注射等級(jí)的血清白蛋白和重組人胰島素。
NK培養(yǎng)試劑盒組分的應(yīng)用概述
激活培養(yǎng)基：NKCC-1＋10%自體血漿（滅活） 擴(kuò)增培養(yǎng)基：NKCC-2或NKCC-2＋5%自體血漿（滅活） 激活培養(yǎng)瓶：T-75培養(yǎng)瓶 （自備）+NKCC-3包被培養(yǎng)基 擴(kuò)增培養(yǎng)瓶：可透氣細(xì)胞培養(yǎng)袋或T-225培養(yǎng)瓶 （自備）
試劑和材料
淋巴細(xì)胞分離液（LSM，康寧目錄編號(hào)：25-072-Cl） 不含鈣和鎂的磷酸鹽緩沖鹽（PBS），1×（500 mL）（康寧目錄編號(hào)：21-040-CV） T-75培養(yǎng)瓶（康寧目錄編號(hào)：353024） T-225培養(yǎng)瓶（康寧目錄編號(hào)：431082）
NK細(xì)胞的激活和擴(kuò)增
包被T-75培養(yǎng)瓶（開(kāi)始細(xì)胞培養(yǎng)的前1天） 1. 向15 mL離心管中加入13 mL的PBS及1 mL的NKCC-3用來(lái)制備包被培養(yǎng)基。 2. 將所有的包被培養(yǎng)基（14 mL）轉(zhuǎn)移至T-75培養(yǎng)瓶中。 3. 將預(yù)包被的培養(yǎng)瓶在37℃下孵育4小時(shí)或置于冰箱（2-8℃）中隔夜孵育。 4. 使用T-75培養(yǎng)瓶前先使用移液槍棄掉包被培養(yǎng)基，再用PBS潤(rùn)洗兩次。 5. 將T-75培養(yǎng)瓶置于室溫下風(fēng)干15分鐘。
制備PBMC（第1天） 1. 將經(jīng)抗凝處理的血液在室溫下以400 ×g離心10分鐘后，將血漿（上清液層）轉(zhuǎn)移到新的離心管中。 2. 將自體血漿在56℃下加熱滅活30分鐘后于800 ×g下離心20分鐘以去除沉淀物，將上清液血漿儲(chǔ)存于4℃下，存儲(chǔ)的自體血漿在接下來(lái)10天的細(xì)胞培養(yǎng)中使用。 3. 在血液樣本中加入等體積的PBS作為已被丟棄的自體血漿的代替品用以維持細(xì)胞懸浮液的體積， 然后輕輕地重懸血液。 注意：在PBS中預(yù)先添加0.1％人血清白蛋白（HSA）有助于維持血細(xì)胞的活力。 4. 根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用淋巴細(xì)胞分離液（LSM）將外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）從上述血液樣本中分離。注意：需采用新鮮的人體血液（收集后2小時(shí)內(nèi)）以獲得具更好的活性;請(qǐng)勿使用超過(guò)24小時(shí)抽取的血液。 5. 將PBMCs用含至少5xPBS（不含鈣和鎂）的體積洗滌后，在室溫下于500 ×g離心10分鐘，收集PBMCs。 注意：使用LSM可從1 mL的新鮮外周血中提取1x106個(gè)細(xì)胞；本NK細(xì)胞培養(yǎng)流程需要30 mL的外周血。
NK細(xì)胞的激活培養(yǎng)（第1-7天） 1. 在實(shí)驗(yàn)第1天向30 mL的NKCC-1培養(yǎng)基中加入自體血漿至最終濃度為10％，以制備激活培養(yǎng)基。 2. 將PBMCs懸浮于20 mL的激活培養(yǎng)基（含10％自體血漿的NKCC-1培養(yǎng)基）中，并將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)細(xì)胞/mL。 3. 將20 mL的PBMCs懸液轉(zhuǎn)移至預(yù)先包被的T-75培養(yǎng)瓶后，放置在5% CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天。 4. 第3天或第4天根據(jù)PBMCs的細(xì)胞狀態(tài)來(lái)添加10 mL的激活培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)2天。 5. 在第6天將所有（30 mL）的PBMCs懸液收集到50 mL的離心管中，并在800 xg下離心5分鐘。 6. 吸除上清液后向細(xì)胞培養(yǎng)袋中加入適量（例如130 mL）的含5％自體血漿的NKCC-2培養(yǎng)基， 并將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個(gè)細(xì)胞/mL后進(jìn)行孵育培養(yǎng)。 注意：若加入的培養(yǎng)基體積小于100 mL，則將細(xì)胞培養(yǎng)于在T-75培養(yǎng)瓶中；若加入的培養(yǎng)基體積超過(guò)100 mL，則需將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)袋或T-225培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
NK細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)（第8-11天） 1. 每2到3天檢測(cè)細(xì)胞的密度及活率，并根據(jù)細(xì)胞增殖狀態(tài)加入新鮮的NKCC-2培養(yǎng)基，將細(xì)胞密度維持在5×105個(gè)細(xì)胞/mL的水平。 注意：建議在NK細(xì)胞擴(kuò)增期間添加的新鮮培養(yǎng)基中補(bǔ)充0.5％至1％的自體血漿，直至其耗盡為止。 2. 第11天將NK細(xì)胞收集后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞分析。 注意：若后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要更高的細(xì)胞數(shù)量，可添加新鮮的581淋巴細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（康寧目錄編號(hào):88-581-CM）來(lái)延長(zhǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)期。
參考文獻(xiàn)
1. Zhang C, Zhang J, Niu J, Zhou Z, Zhang J, Tian Z. Interleukin-12 improves cytotoxicity of natural killer cells via upregulated expression of NKG2D. Hum Immunol 2008; 69:490-500. 2.Zhang C, Zhang J, Sun R, Feng J, Wei H, Tian Z. Opposing effect of IFN gamma and IFN alpha on expression of NKG2 receptors: negative regulation of IFN gamma on NK cells. Int Immunopharmacol 2005; 5:1057-67.
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