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·         使用 CRISPR/Cas9 進行基因組編輯概述

·         慢病毒試劑

·         TransIT^®-LT1 廣譜轉染試劑

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Ideal for Recombinant Lentivirus Production

TransIT^®-Lenti 轉染試劑 -

重組慢病毒顆粒概述及靶細胞感染。
(1) 用編碼目的基因，水泡性口炎 G 蛋白 (VSV-G) 和必需病毒蛋白（例如 gag，pol 和 rev）的 3-4 種質粒轉染生產細胞（例如 293T）。(2) 通過用生產細胞質膜出芽組裝病毒并釋放到上清液中，得到用 VSV-G 修飾的包膜。將含有病毒的培養基通過 0.45 μm 過濾器過濾以除去任何細胞。(3) 靶細胞經常在聚陽離子存在下用重組慢病毒顆粒轉導，以增加聚集和攝取。病毒進入細胞，衣殼未被包裹，顯示 RNA 基因組和病毒酶。病毒 RNA 被逆轉錄成 DNA，然后整合到宿主基因組中。(4) 轉錄和翻譯導致由目的基因編碼的蛋白質的產生。

具有 TransIT®-Lenti 轉染試劑的高功能滴度。
將粘附的 293T/17 細胞用 pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP™ 轉移載體轉染到 6 孔板中，用 MISSION™ （1:1 比例，2μg/孔）驅動的慢病毒包裝混合物用以下試劑轉染：TransIT®-Lenti（3:1，體積重量比），Lipofectamine® 2000 (3:1)，Lipofectamine® 3000 (3:1:1)，25 kDa PEI (6:1) 或 CaPO4 沉淀（4 μg pDNA） /孔）。收獲上清液，過濾 (0.45 µm)，并使用 293T/17 細胞滴定。在 8 μg/ml TransduceIT™ 存在下進行慢病毒轉導，并使用 Guava easyCyte™ 5HT 流式細胞儀在轉導后 72 小時測量 GFP 表達。誤差條表示單獨滴定的一式三份轉染復合物。使用具有少于 20% GFP 陽性細胞的病毒稀釋液計算功能滴度。

使用 TransIT^®-Lenti 轉染試劑進行高效轉染。
使用 TransIT^®-Lenti 轉染試劑（3:1，體積重量比），使用 MISSION™ 載體（pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP™ 轉移載體和慢病毒包裝混合物）以 6 孔板形式轉染粘附的 293T/17 細胞。轉染 48 小時后，使用 Guava easyCyte™5HT 流式細胞儀檢測 GFP 效率。誤差條代表五個轉染復合物。使用 Zeiss Axiovert S100 倒置熒光顯微鏡在轉染后 48 小時（10 倍物鏡）捕獲圖像。觀察到的細胞變圓和細胞 - 細胞融合是由于水泡性口炎病毒 G 蛋白 (VSV-G) 的高表達，用于對重組慢病毒進行假型化。

慢病毒生產可放大。
使用 MISSION™ 載體（pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP™ 轉移載體和慢病毒包裝混合物（1:1 比例））以及 TransIT^®-Lenti 轉染試劑（3:1，體積重量比），以 12 孔、6 孔板或100 mm 平板形式轉染粘附的 293T/17 細胞。收獲上清液，過濾 (0.45 µm)，并使用 293T/17 細胞滴定。在 8 μg/ml TransduceIT™ 存在下進行慢病毒轉導，并使用 Guava easyCyte™ 5HT 流式細胞儀在轉導后 72 小時測量 GFP 表達。誤差條表示單獨滴定的一式三份轉染復合物。使用具有少于 20% GFP 陽性細胞的病毒稀釋液計算功能滴度。

使用 TransIT^®-Lenti 進行無濃縮慢病毒的高轉導效率。
使用 MISSION™ 載體（pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP™ 轉移載體和由 MISSION™ 提供支持的慢病毒包裝混合物），利用 TransIT®-Lenti 轉染試劑（3:1，體積重量比）或 Lipofectamine®2000 生產慢病毒。收獲上清液，過濾 (0.45 µm)，并冷凍。利用 iCell®MotorNeurons (Cellular Dynamics International) 鋪板后 5 天進行慢病毒轉導。對于 TransIT^®-Lenti 和 Lipofectamine^® 2000，在 96 孔板的每個孔中加入 1 微升未濃縮的上清液。使用 guava easyCyte™ 5HT 流式細胞儀在轉導后 72 小時測量 GFP 效率。誤差條表示重復孔的 SEM。(B) 將 iCell® 運動神經元接種于 Ibidi 35 mm 培養皿中，并用使用 TransT®-Lenti 轉染試劑和 MISSION™ 載體生產的慢病毒轉導。使用 Zeiss Axiovert S100 倒置熒光顯微鏡，使用 63 倍浸油物鏡，在轉導后 72 小時捕獲圖像。

特性

·         高性能 – 提供高達八倍的功能滴度

·         簡便的實驗方案 – 無需更換介質，單一收獲物

·         無動物源性成分 – 高性能可靠性

描述

·         TransIT®-Lenti 轉染試劑旨在增強包裝和轉移載體向貼壁 HEK293T 細胞類型的傳遞，并增加重組慢病毒的產生。

·         包裝質粒包括慢病毒基因組的結構 (gag)、酶 (pol)、包裝 (rev) 和包膜 (VSV-G) 等基本病毒組分。該轉移質粒編碼目的基因，其兩側是長末端重復序列 (LTR)，以及 RNA 包裝信號(Psi) 和 rev 響應元件 (RRE) 等其他必要成分。

重組慢病毒生產概述

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