小鼠生物發光活體成像

（一）技術原理

1.標記原理

哺乳動物生物發光，一般是將Firefly luciferase基因（由554個氨基酸構成，約50KD）即熒光素酶基因整合到預期觀察的細胞染色體DNA上以表達熒光素酶，培養出能穩定表達熒光素酶的細胞株，當細胞分裂、轉移、分化時, 熒光素酶也會得到持續穩定的表達。基因、細胞和活體動物都可被熒光素酶基因標記。將標記好的細胞接種到實驗動物體內后，當外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內產生發光現象。這種酶在ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應才可以發光，因此只有在活細胞內才會產生發光現象，并且發光光強度與標記細胞的數目線性相關。

除Firefly Luciferase外，有時也會用到Renilla Luciferase。二者的底物不一樣，前者的底物是熒光素（D-luciferin），后者的底物是coelentarizine。二者的發光波長不一樣，前者所發的光波長在540~600nm，后者所發的光波長在460~540nm左右。前者所發的光更容易透過組織，后者在體內的代謝比前者快，而且特異性沒有前者好，所以大部分活體實驗使用Firefly Luciferase作為報告基因，如果需要雙標記，也可采用后者作為備選方案。

熒光素酶的發光是生物發光，不需要激發光，但需要底物熒光素。熒光素在氧氣、ATP存在的條件下和熒光素酶發生反應，生成氧化熒光素(oxyluciferin)，并產生發光現象。

2.底物熒光素的特點

熒光素由于諸多優點得到廣大科研人員的青睞，主要特點如下：

(1)熒光素不會影響動物的正常生理功能。

(2)熒光素是280道爾頓的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細胞膜和血腦屏障。

(3)熒光素在體內擴散速度快，可通過腹腔注射或尾部靜脈注射進入動物體內。腹腔注射擴散較慢，持續發光長。熒光素腹腔注射老鼠后約1min后表達熒光素酶的細胞開始發光，10min后強度達到穩定的最高點，在最高點持續約20~30 min后開始衰減，約3h后熒光素排除，發光全部消失，最佳檢測時間是在注射后15~35min之間；若進行熒光素靜脈注射，擴散快，但發光持續時間很短?？蒲腥藛T根據大量的實驗總結出熒光素的合適的用量是150mg/kg，即體重20克的小鼠需要3毫克的熒光素。

(4)觀察時間的間隔沒有最短限制，只要觀察的條件控制一致就可以。雖然底物在動物體內有一定的代謝過程，但是上一次底物的殘留曲線可以知道，可以控制對下一次觀察結果的影響。

3.光學原理

光在哺乳動物組織內傳播時會被散射和吸收，光子遇到細胞膜和細胞質時會發生折射現象，而且不同類型的細胞和組織吸收光子的特性并不一樣。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內可見光被吸收的主要因素，其吸收可見光中藍綠光波段的大部分。但是在可見光大于600納米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。利用活體動物生物發光成像技術最少可以檢測到皮下的幾百個細胞。當然，由于發光源在老鼠體內深度的不同可看到的最少細胞數是不同的。一般認為，每一厘米深度，發光強度衰減10倍，血液豐富的組織或器官（比如心臟、肝臟、肺臟）衰減多，與骨骼相鄰的組織或器官衰減少。在相同的深度情況下，檢測到的發光強度和細胞的數量具有非常好的線性關系，可由儀器量化檢測到的光強度，反映出細胞的數量。

（二）小鼠生物發光活體成像技術特點

（三）生物發光活體成像用途

（四）實驗操作流程

1.腫瘤細胞標記

  首先用螢光素酶標記所要研究的腫瘤細胞，我們利用帶luciferase基因，puromycin或blasticidin抗性的慢病毒載體，先包裝成慢病毒，然后感染腫瘤細胞，最后抗性篩選出穩轉luciferase的腫瘤細胞。接下來可以繼續按照客戶需求對該穩轉細胞株進行其它基因改造操作。

2.體外預實驗檢測

  需要檢測的腫瘤細胞標記后，在活體成像前，可以通過檢測熒光素酶的表達強度，繪制標記細胞的發光梯度曲線等。體外預實驗是作為小動物活體成像解決方案中不可缺少的一部分。比如，利用體外預實驗初步檢測轉染熒光素酶的腫瘤細胞發光值。  

3.穩轉luciferase細胞接種小鼠

  接種方式按照實驗目的不同有幾種，原位接種，皮下接種，腹腔接種以及靜脈接種，可分別觀察原位瘤，皮下瘤以及轉移瘤等。如果是人源的腫瘤細胞，必須用裸鼠作為受體，如果是鼠源細胞系則無所謂，但是前提是所用細胞必須能成瘤。

4.活體成像

  細胞接種一段時間后，可以進行活體成像檢測。首先麻醉實驗動物，可采用異氟烷（isoflurane）或克他命/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine）混合液麻醉實驗動物。 接著注射底物熒光素，最佳的檢測時間是在注射后10到35分鐘之間。但需要注意的是，對于不同的動物模型，發光動力學過程并不完全一致，最好先進行預實驗確定何時發光信號最強。

（五）北京畢特博生物技術有限責任公司穩轉luciferase細胞株列表

黑色 素瘤	B16-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤，尾靜脈2星期，強轉移能力
	B16F10-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤，尾靜脈2星期，強轉移能力
	SK-Mel-1-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
	A375-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
前列腺癌	PC3-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
	RM-1-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
	DU 145-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
肝癌	Hep G2-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
	7721-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤，2個月轉移到肺，尾靜脈不能轉移
	SK-Hep1-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
	Hep3B-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
	Hep1-6-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
乳腺癌	MDA-MB-231-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤，原位瘤，尾靜脈肺轉移瘤
	4T-1-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下、原位、尾靜脈肺轉移
	MCF-10A-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
	MDA-MB-435-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤，原位癌，尾靜脈肺轉移成瘤
	MCF7-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
肺癌	A549-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤，成瘤率75%左右
	LLC-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤能力強
甲狀腺癌	SW579-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤能力強
	TT-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
胰腺癌	SW1990-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
	PANC-1-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
骨肉瘤	U-2OS-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
	Saos-2-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
	SW 1353-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下成瘤
結直腸癌	HCT116-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇;皮下，尾靜脈2個星期轉移到肺臟
	Lovo-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇; 皮下成瘤
	SW480-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇; 皮下成瘤
	SW620-luc	puromycin,blasticidin兩種抗生素篩選可供選擇; 皮下成瘤，尾靜脈2個星期轉移到肺臟

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