鑒定：支原體是一類缺乏細胞壁的細胞，呈高度多形性，細胞培養(yǎng)中被支原體污染是比較常見的問題，因為污染來源太多，包括工作環(huán)境、操作者、血清、實驗器材等，鑒定的方法如下。
1. 相差顯微鏡觀察。其中可以采用直接觀察或地衣紅染色觀察，直接觀察時，位于細胞表面和細胞之間的暗色微小顆粒為支原體，但要與線粒體區(qū)分。
2. 熒光染色法。將細胞接種于蓋玻片上，在細胞未長滿前取出玻片，用不含酚紅的Hank's液漂洗后，再用1:3醋酸甲醇固定10min，然后用生理鹽水漂洗，置于用生理鹽水配制的 Hoechst 33258(濃度為50ul/ml)中染色10min，熒光染料將支原體內(nèi)的DNA著色，染色后用蒸餾水洗1~2min，滴加pH5.5磷酸緩沖液數(shù)滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下散于細胞周圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點為支原體。
3. 電鏡檢查。制備電鏡標本，用掃描電鏡或透射電鏡觀察。
4. DNA分子雜交檢查。按試劑盒說明進行，檢出率高，但方法較復雜。
5. PCR。現(xiàn)有支原體PCR檢測試劑盒銷售，可按說明書檢測支原體污染。
上：支原體污染細胞熒光圖
下：無污染細胞熒光圖
圖片來源：互聯(lián)網(wǎng)
預防：支原體污染屬于微生物污染，預防手段與真菌污染相近，在此基礎上，可用100微克每毫升的卡那霉素抑制支原體，但可能對細胞有所損傷，盡量不加抗生素。
污染去除：
1. 抗生素處理:。用100微克每毫升卡那霉素清除培養(yǎng)物中的支原體污染。亦有將細胞培養(yǎng)瓶直放,瓶內(nèi)裝人含600ug/ml 卡那霉素的生長液至瓶頸部,37C孵育 18h,然后移人含200ug/ml卡那霉素的生長液，可成功處理支原體。金霉素對細胞毒性較卡那霉素大，常用濃度為100~200ug/ml。對卡那霉素、四環(huán)素有抗藥性的支原體可用泰樂菌素處理，對培養(yǎng)細胞無不良影響，污染細胞以50ug/ml泰樂菌素處理6天，或連續(xù)處理2代，可長期有效地清除支原體污染。
2. 高熱處理。因支原體和細胞對熱的耐受性不同，將受污染的細胞41℃作用5~10h，最長達18h，可以破壞支原體，而細胞僅少許損傷,即可恢復。對溫度敏感的細胞株不能采用這種方法。
3. 巨噬細胞和抗生素聯(lián)合處理。將同種動物腹腔巨噬細胞加入被支原體污染的細胞中(巨噬細胞與污染細胞比例為100:1)，再加入100ug/ml的抗生素，結合支持物方法培養(yǎng)逐日檢查，直至支原體被巨噬細胞消除。
4. 鼠的傳代培養(yǎng)。如果還是無法消除污染，該細胞為高價值的腫瘤細胞，則可以將腫瘤細胞接種與BALB/c裸鼠的頸背部（每只接種4×106細胞），接種3-5只，一個月后取瘤塊進行原代培養(yǎng)。
5. 血清處理。將污染的細胞接種于含 10% 非滅活血清培養(yǎng)基中，孵育 6h后，去除了包括人-人雜交瘤在內(nèi)的5種細胞系中污染的支原體，其中起作用的是補體成分。
6. 支原體去除試劑。用MRA處理細胞，每4天換一次液，連續(xù)處理15天。也有網(wǎng)友推薦MycoplasmaOUT™ Treatment試劑，用一天后，細胞恢復生長。
有關病毒污染的資料不多，但一般認為病毒污染不影響細胞培養(yǎng)，通過PCR技術可以檢測。不過病毒污染對生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，至今，潛在病毒是細胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作的難題。有研究顯示用伽馬射線可清除牛血清的大部分病毒，現(xiàn)如今最值得期待的是下游工藝中除病毒過濾器的開發(fā)。
鑒定：
1. 形態(tài)學鑒定。形態(tài)觀察是辨認細胞最簡單和最直接的方法，但我們也應意識到它有
一定的不足，因為其中多數(shù)細胞形態(tài)與不同培養(yǎng)環(huán)境對細胞形態(tài)的可塑性有關。例如,在單層匯合狀態(tài)心部位生長的上皮細胞，一般形態(tài)規(guī)則，呈多角形，而且邊緣清晰明確，而生長在小片邊緣同樣的細胞，形態(tài)就不規(guī)則，呈伸開狀；如果發(fā)生轉化，就會從小片上脫離，變?yōu)槌衫w維細胞樣的形態(tài)。
2. 種屬鑒定。染色體分析是區(qū)分物種的最佳方法。 同工酶電泳也是一種較好的診斷
檢測方法，而且比染色體分析快，但需要合適的儀器和試劑。
3. 譜系或組織標記。如細胞表面抗原、中間纖維蛋白、酶類、分化產(chǎn)物，根據(jù)以上物
質的差異，運用流式細胞術等技術，鑒定是否發(fā)生細胞交叉污染。
4. STR分型。
預防：1. 實驗器材如吸管不能混用。幾種細胞同時實驗時,器材要做好專用標記。
2. 細胞培養(yǎng)液公用時，細胞吸管和細胞用液要分開，千萬不能用細胞吸管直接吸取細胞培養(yǎng)液。吸取培養(yǎng)液的吸管尖端不要觸及培養(yǎng)瓶瓶口，避免把細胞帶到培養(yǎng)液瓶中，防止進行其他細胞培養(yǎng)操作時導致細胞污染。
3. 所有轉來的細胞或自己所建的細胞系都要在早期留有充足的凍存樣本備用，一旦發(fā)生細胞交叉污染，可以復蘇早期凍存細胞來使用。
去除方法：解決細胞交叉污染的問題最好的方法就是進行單克隆化，前提是要保證原細胞株還存在。具體是通過有限稀釋法實現(xiàn)單克隆化，然后運用鑒定手段確保不存在其他雜細胞，即可去除細胞交叉污染。
