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EGM-2-MV微血管內皮細胞培養基(貨號：CC-3202） FBS濃度為5% (點擊標題進入）

細胞的代謝和功能是耦聯的，這一現象在血管內皮細胞表現十分明顯。血管內皮細胞是一個強大的代謝器官，能攝取、轉換、滅活多種活性物質，以維持這些活性物質在體內的一定濃度，進而精細調節生理功能，保持內環境的穩定。機體血管主要受血管周圍神經叢和血管內皮細胞的雙重調控。人臍血管無神經支配，也存在局部調控機制，其調控作用主要通過內皮細胞合成和釋放的血管活性多肽，經細胞內信號轉導途徑而實現。

    血管內皮細胞，特別是肺血管內皮細胞，在血管活性物質的代謝中具有特殊意義。因全身血液均要在肺泡和肺泡毛細血管間進行氧合、排除二氧化碳。肺毛細血管內腔表面積達70 m²，按單位組織重量計算，是體內血管內皮細胞最多的器官。循環血液中許多物質是由肺血管內皮細胞攝取，再經細胞內專有酶活化或降解的。

    1  攝取轉換、改變活性

    1.1  攝取、前體、合成活性物質

    血管內皮細胞合成釋放的許多活性物質，多是攝取循環血液中的原料或前體物，再經細胞內特有的酶加工后生成、釋放的。如PGI₂是由血管內皮細胞攝取花生四烯酸后，經環氧合酶、前列腺素合成酶加工而生成。EDRF是內皮細胞在乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）作用下，激活一氧化氮合酶，以L-精氨酸為底物生成的。ET則是內皮素肽原在內肽酶作用下轉化為ET前體，再經內皮素轉化酶催化而生成的。

    由血管內皮細胞，特別是肺血管內皮細胞合成的ACE，是二肽羧基肽酶，是一種含鋅的糖蛋白。該酶將血循環中無活性的十肽AgI，轉換成有高度活性的八肽AgII。

    1.2  攝取滅活血中的活性物質

    循環血液中含有多種活性物質，為了保持機體的穩定，內皮細胞可以攝取并滅活血中的活性物質。

    1）胺類：血管內皮細胞攝取滅活的胺類物質有兒茶酚胺類（包括去甲腎上腺素、腎上腺素和異丙腎上腺素）、5-HT、組胺等。但肺血管內皮細胞對組胺、異丙腎上腺素及腎上腺素等無明顯的降解、滅活作用。

    2）脂類：血管內皮細胞代謝滅活的脂類物質包括前列腺素類（PGs，其中主要是PGE₂、PGF₂）以及LTs和PAF等。PGs經內皮細胞攝取后，由15-羥-PG脫氫酶降解。PAF由乙酰基水解酶降解失活。LTs主要是在粒細胞中氧化滅活，或經過氧化物酶滅活。

    3）肽類：血管內皮細胞對肽類的滅活作用目前所知不多。BK經ACE血管緊張素轉化酶滅活。胰島素、P物質、血管活性腸肽可被部分滅活。

    2  合成、釋放舒血管活性物質

    內皮細胞可以合成、釋放舒血管活性物質。

    2.1  前列環素

    血管內皮細胞是合成前列環素（PGI₂）的主要場所。血管內皮細胞可攝取循環血液中的花生四烯酸（arachidonic acid，AA），也可由磷脂酶A催化內皮細胞膜磷脂生成AA。AA再經環氧合酶代謝途徑，先生成內過氧化物（PGH₂），再經細胞微粒體中的前列環素合成酶的作用，生成PGI₂。血管內皮細胞較平滑肌細胞生成的PGI₂要多10～20倍。PGI₂在水溶液中極不穩定，半衰期約為幾秒。因此，PGI₂不是一個循環的活性物質，而是在局部釋放和局部起作用的活性物質。

    刺激內皮細胞合成PGI₂的因素較多，包括機械刺激，如血流剪切應力的變化；活性物質，如5-HT、ACh、PDGF、IL-1、AA、凝血酶、磷脂酶A₂、ATP、ADP、低氧、鈣離子載體（Ca²⁺ionophor）A23187等，均可使內皮細胞合成PGI₂增多。而BK、Hist、AgII、亞油酸、脂肪酸等可抑制培養的內皮細胞合成PGI₂。隨年齡增長或伴有動脈粥樣硬化、糖尿病等病理狀態時，血管內皮細胞合成釋放PGI₂減少。

    PGI₂是強烈的血管平滑肌舒張劑，能擴張血管，并抑制血小板聚集，并使已聚集的血小板解聚。PGI₂還可減少ET的合成釋放，并減弱其在體內的縮血管效應。

    PGI₂與細胞膜上相應受體相結合，激活腺苷酸環化酶，致使胞內cAMP含量升高，發揮其松弛平滑肌細胞和抑制血小板聚集的作用。

    2.2  內皮依賴性舒張因子

    乙酰膽堿(Ach)舒張血管的作用依賴于內皮細胞，內皮細胞完整時則出現舒張，內皮細胞不完整或缺失時，ACh的舒張作用減弱或消失。內皮細胞在ACh的作用下，能產生可擴散性的舒張平滑肌細胞的物質。環氧合酶抑制劑不能緩解其舒張作用，表明該物質與經環氧合酶代謝產生的PGI₂不同，故稱為內皮依賴性舒張因子（EDRF）。BK、硝普鈉等硝基類舒張血管物質，其舒血管作用也取決于內皮細胞是否完整。這些物質舒張血管平滑肌的作用，也是通過內皮細胞釋放EDRF來介導的。

    不同種屬動物，不同部位的血管均可產生EDRF，但其內皮依賴性舒張作用略有差異。

    目前認為EDRF的化學本質是一氧化氮（NO）。血管內皮細胞有產生NO的體系，左旋精氨酸（L-arginine，L-Arg）是合成NO的前體物。ACh與內皮細胞膜上的M₂受體結合后，使內皮細胞中的三磷酸肌醇（IP₃）濃度升高，進而升高[Ca²⁺]i。在鈣調素（calmodulin）的輔助作用下，激活胞內的一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）。NOS在輔酶存在時便可使L-Arg轉變成為對羥基-L-Arg，后者與氧發生反應，生成等克分子量的NO和L-胍氨酸。

    NO是一種氧化物，極易被氧化失活，氧化后或推動氧化狀態時，活性消失。NO親脂性強，易透過生物膜，生成釋放后擴散到血管腔及內皮細胞下的平滑肌，NO擴散到內皮細胞下顯著多于血管腔。擴散到內皮細胞下的平滑肌，使平滑肌舒張，進而導致血管擴張。EDRF擴散到血管腔，抑制血小板與內皮細胞間的粘附，并抑制凝血酶引起的血小板[Ca²⁺]i的升高伴隨的血小板聚集，阻止血栓形成。

    高血壓或支氣管哮喘患者及高血壓動物，其內皮細胞受損，使NO合成釋放減少。氧化修飾的低密度脂蛋白也可使NO合成減少。在相應病理過程的發生中有一定作用。

    EDRF同PGI₂有協同作用，增強它們對血管的擴張效應和對血小板粘附、聚集的抑制作用。此外，EDRF還可穩定溶酶體膜和抗氧化自由基損傷，保護細胞免受超氧陰離子的損傷，抑制脂質過氧化和自由基的產生，是細胞保護因子。

    EDRF舒張血管平滑肌細胞及抑制血小板聚集的作用，是通過與其相應的膜受體相結合，激活胞內可溶性鳥苷酸環化酶，使cGMP含量升高，[Ca²⁺]i下降，進而活化cGMP依賴性蛋白激酶，改變胞內一系列蛋白質磷酸化狀態，致使肌球蛋白輕鏈脫磷酸化，平滑肌細胞松弛。美藍可抑制cGMP的生成，故可抑制內皮依賴性舒張作用。

    有資料認為EDRF不完全等同于NO。目前一個可能的解釋是EDRF通過NO而發揮作用。即許多內皮依賴性的舒血管物質的作用，都是通過NO的生成釋放而發揮作用的共同道路。

    2.3  血管內皮細胞超極化因子

    ACh作用于血管內皮細胞，還可釋放血管內皮細胞超極化因子（endothelium derived hyperpolarizing factor，EDHF）。EDHF也能使平滑肌細胞舒張，擴張血管。血管內皮依賴性超極化作用可易化血管舒張，減弱血管壁對一些收縮血管活性物質的反應性。

    EDHF的作用不受NOS抑制劑左旋硝基精氨酸、消炎痛或優降糖（glibenclamide）的影響，表明該超極化因子不同于NO或PG_S類活性物質。

    3  血管內皮細胞合成與釋放的縮血管活性物質

    血管內皮細胞可產生使血管平滑肌細胞收縮的物質，即血管內皮衍生的收縮因子（endothelium derived contracting factor，EDCF）。其后發現，在不同種屬、不同部位的血管內皮細胞均可產生EDCF，但其性質略有差異，目前已知的有三類EDCF。

    3.1  內皮素

1988年，Yanagisawa從豬主動脈內皮細胞中分離純化出21個氨基酸組成的多肽，稱內皮素（endothelin，ET，EDCF3）。人及哺乳動物體內有四種結構及藥理學性質略有差異的異構體，分別定為ET-1，ET-2，ET-3和ET-4。人血管內皮細胞中可提取到ET-1，ET-2和ET-3。

    含38個氨基酸的內皮素前體，稱大內皮素（big endothelin），是經內皮素轉化酶催化而生成的具有強烈活性（由21個氨基酸組成）的成熟ET。在組織中，內皮素主要以前體形式存在。除血管內皮細胞外，許多其它組織如平滑肌細胞、肺和神經組織等也能產生ET。在人主要是ET-1。ET-1及其受體廣泛存在于各種組織細胞，因而參與多種功能的調節。但在生理條件下，ET-1在血漿中含量較低，約為5 ng。故ET-1不是一個循環激素，而是局部合成釋放、局部起作用的活性物質，半衰期約1 h。

    ET-1在局部合成釋放后同相應受體結合，發揮生物效應，隨之降解。在血循環中的ET-1，可經腎臟隨尿排出，或經肺臟時被代謝滅活。

    ET-1是目前已知的最強的血管收縮劑，在人及大多數種屬動物的不同部位的動脈、靜脈和微血管，以及離體血管，ET-1均顯示出其強烈而持久的收縮作用。ET-1對靜脈的作用比動脈強，其收縮血管的效應是去甲腎上腺素的100倍、PGF₂的1000倍。腎上腺素受體、膽堿受體、組胺H₁受體、5-HT受體等受體阻斷劑，或PGs合成抑制劑，均不影響ET的縮血管效應。而異丙腎上腺素、心鈉素、三硝基甘油及降鈣素基因相關肽，可部分抑制ET的作用。

    內皮素受體分布廣泛，幾乎所有組織細胞均有ET的受體。受體亞型主要有A、B兩型。A型主要分布在平滑肌細胞；B型主要分布在內皮細胞。ET作用于平滑肌細胞上的A、B型受體，均能使平滑肌收縮。ET作用于內皮細胞上的B型受體，可使內皮細胞釋放內皮依賴性舒血管物質，如EDRF、PGI₂，而使血管舒張。然而ET的舒血管效應，常被A型受體興奮所引起的平滑肌細胞強烈而持久的收縮所掩蓋。內皮素受體的結構與G-protein受體家族相似。通過信號傳遞通路，內皮素受體參與血管的收縮,調節細胞的某些機能。內皮素在顱腦創傷后腦水腫的形成中起重要作用，其作用是通過內皮素A受體調節的，應用內皮素A受體拮抗劑可防治顱腦創傷后繼發性腦水腫。

    近年來，人們發現一組機體識別和調控內皮素作用的蛋白質分子：即LBP/CD₁₄系統：包括血清脂多糖結合蛋白（lipopolysaccharide-binding protein，LBP）、細胞表面膜結合CD₁₄（membrane bound CD₁₄，mCD₁₄）和可溶性CD₁₄（soluble CD₁₄，sCD₁₄）。LBP是ET的重要載體蛋白，mCD₁₄是單核、巨噬細胞等CD₁₄+細胞表面的內皮素受體，sCD₁₄則是調節內皮細胞等CD₁₄細胞的重要介質。LBP/CD₁₄系統能明顯提高各種細胞對ET的敏感性。

    3.2  低氧誘生的血管內皮收縮因子

    低氧可使腦、肺血管收縮，去內皮細胞后這種收縮反應減弱，提示有內皮依賴性收縮因子的釋放，這種因子稱為EDCF₁。低氧所致的EDCF₁作用迅速而短暫，磷脂酶A₂、脂氧合酶抑制劑不能阻斷這種作用，但Ca²⁺拮抗劑可阻斷這種收縮因子的作用。因而EDCF₁不是花生四烯酸的代謝產物，也不可能是內皮素。因內皮素不貯存在細胞中，且作用緩慢而持久。曾對低氧引起的EDCF₁進行生物測定，尚未獲成功。目前對其化學本質了解不多。培養豬肺、腦動脈內皮細胞與平滑肌細胞，肺動脈內皮細胞缺氧時，有Ca²⁺內流增加、IP₃和cAMP無明顯變化，cGMP于缺氧4 min升至高峰，隨即回降；而腦動脈內皮細胞缺氧時，不僅有Ca²⁺內流，且有內鈣釋放、IP₃和cAMP增多，cGMP濃度在缺氧8 min時仍繼續上升。缺氧時肺與腦動脈平滑肌細胞間第二信使的變化，僅有cGMP不同。可見，內皮細胞的異質性，可能與兩血管反應性差異有關。

    3.3  環氧合酶依賴性血管內皮收縮因子

    有些血管內皮細胞合成環氧合酶的代謝產物，進而介導內皮依賴性血管收縮反應，這種內皮依賴性收縮因子統稱為EDCF₂。環氧合酶抑制劑可阻斷這一反應。內皮細胞合成環氧合酶的因子又可分成以下幾類：

    1）外源性花生四烯酸誘發的內皮細胞依賴性收縮因子：給外源性花生四烯酸可誘發內皮依賴性血管收縮。環氧合酶抑制劑可阻斷該反應，但PGI₂或TXA₂合成酶抑制劑不能阻斷該反應。表明有一種非PGI₂、又非TXA₂的環氧化物產物介導該反應。在無任何刺激情況下的兔主動脈環，外源性花生四烯酸引起有內皮細胞的血管條的收縮反應，明顯大于無內皮細胞的血管條。

    2）牽張誘發的內皮細胞依賴性收縮因子：牽張可誘發狗基底動脈內皮細胞依賴性收縮，環氧合酶抑制劑——消炎痛可阻斷該反應，提示有環氧合酶產物介導牽張誘發的內皮依賴性收縮。內皮細胞膜上有牽張激活的離子通道，能感知機械力的刺激。

    3）壓力引起的內皮細胞依賴性收縮因子：增加貓大腦中動脈跨壁壓，可導致血管平滑肌去極化，使血管收縮。該反應也是內皮細胞依賴性的，可能是由于跨壁壓誘發了稱為EDCF₂的內皮細胞依賴性的收縮因子的釋放。

    4）前列腺素H₂（PGH₂）：TXA₂合成酶抑制劑不能阻止狗靜脈注射花生四烯酸或給ACh注射狗腦動脈，誘發內皮細胞依賴性收縮。環氧化酶抑制劑——消炎痛和TXA₂受體拮抗劑，可使組氨酸血癥（hist）誘導出人大隱靜脈的內皮細胞依賴性舒張。提示PGH₂的釋放可能介導這種反應。

    5）血栓素A₂（TXA₂）：TXA₂合成酶抑制劑可阻止狗腦動脈對去甲腎上腺素、尼古丁、A23187等誘導的內皮依賴性收縮；還可減弱離體兔肺動脈內皮細胞依賴性收縮對ACh的易化作用。TXA₂亦可介導內皮依賴性收縮，屬EDCF₂。

    6）超氧陰離子：環氧合酶的激活，除導致PGs生成外，還產生超氧陰離子，誘發狗基底動脈收縮。超氧離子也是環氧合酶依賴性的EDCF。

    3.4  血管緊張素II

    血管壁的內皮細胞及平滑肌細胞能合成血管緊張素轉換酶（ACE）。此外，血管壁細胞也可合成腎素和血管緊張素原。用特異性腎素免疫組織化學法，證明培養的平滑肌細胞含有腎素樣活性物質及血管緊張素原。分子雜交技術也證明在血管壁存在腎素、血管緊張素原、ACE及AgII的mRNA表達。于是在血管壁內有兩個酶（腎素和ACE）和一個底物（血管緊張素原）組成的獨立于腎臟局部的腎素-血管緊張素系統（RAS）。

血管壁細胞除可局部合腎素和血管緊張素原外，血管內皮細胞還可攝取血液循環中的腎素。腎素作用于血管緊張素原，生成無血管活性的十肽AgI。AgII主要是在流經肺循環時，經肺血管內皮細胞上的ACE轉換成有高度血管活性的八肽AgII。AgII還可經氨基肽酶作用生成AgIII。可見，血管的RAS主要以自分泌及旁分泌的方式，給局部提供高濃度的AgII，以調節血管的緊張度及血流量。

    AgII是強烈的血管收縮劑，并能刺激醛固酮的分泌。AgIII也有AgII同樣的作用。

    AgII除作用于平滑肌細胞膜上的受體，引起血管平滑肌細胞收縮外，還可作用于交感神經末梢，引起去甲腎上腺素的釋放，間接引起平滑肌細胞收縮。AgII可誘導內皮細胞ET基因表達增強，并增加血管的反應性。但AgII與PDGF、TGF-b比較，促ET合成的作用弱。另一方面，AgII作用于內皮細胞，使其合成釋放PGI₂、EDRF等舒血管因子，反饋性調節血管緊張性。

    AgII還可促進平滑肌細胞的增殖。

    4  內皮細胞合成釋放的促進與抑制平滑肌細胞生長的物質

    機體發育成熟后，血管平滑肌細胞多由合成表型轉化為收縮表型。

    4.1  促進平滑肌細胞增殖的物質

    1）血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）：除血小板顆粒中貯存的PDGF是其重要來源外，內皮細胞與平滑肌細胞也能合成、分泌PDGF。PDGF是陽離子蛋白質，是平滑肌細胞、成纖維細胞等間質細胞強烈的促有絲分裂劑。PDGF由A、B兩條肽鏈，以二硫鍵連接構成三種形式的異構體，即PDGF-AA，PDGF-AB和PDGF-BB。PDGF受體有兩種亞型。受體與PDGF配體相結合，進而發揮其促生長效應。

    2）轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）：轉化生長因子有TGF-a和TGF-b兩種。TGF-a與表皮生長因子（epithelium growth factor，EGF）有共同的受體，可促進平滑肌與上皮細胞的生長。單獨TGF-b的主要作用是抑制細胞的生長與分化，但在有EGF、PDGF同時存在的協同作用下，能促進平滑肌細胞生長。

    3）成纖維細胞生長因子（fibroblastic growth factor，FGF）：成纖維細胞生長因子可由內皮細胞和平滑肌細胞分泌。有酸性和堿性（a-FGF，b-FGF）兩種，堿性較酸性生物活性大10～100倍，但酸性FGF常易與肝素相結合而提高其生物活性30～100倍。FGF是強烈的結締組織細胞促生長因子。在胚胎發育及血管生成中有重要作用，對組織損傷后的修復有促進作用。

    4）內皮素（endothelin，ET）：內皮細胞合成分泌的ET是強烈的血管收縮劑，又有趨化作用。能促使合成表型的平滑肌細胞分裂，迅速而短暫地使c-fos、c-myc mRNA表達增強。將ET加入血管平滑肌細胞的培養液中，可成倍地增加細胞數和DNA合成量。ET可促進正常大鼠血管平滑肌細胞G₀期DNA合成。

    5）血管緊張素II（AgII）：經血管內皮細胞ACE轉化生成的AgII是強烈的血管收縮劑，也能促進血管平滑肌的增殖。

    6）神經肽-Y（neuropeptide-Y，NPY）：NPY主要分布在神經系統，血管內皮細胞也能合成。NPY除有強烈的縮血管作用外，也能促使血管平滑肌細胞生長。

    4.2  產生抑制平滑肌細胞增殖的物質

    1）肝素類蛋白聚糖：血管內皮細胞及平滑肌細胞均可產生抑制平滑肌細胞生長的肝素類蛋白聚糖。其中重要的是硫酸乙酰肝素，它能使血管平滑肌細胞保持靜止狀態。肝素與PDGF的相反作用之間保持動態平衡。血小板中含有分解硫酸肝素酶（heparitinase），可破壞上述動態平衡，增強PDGF的作用。

    2）EDRF，PGI₂：內皮細胞產生的EDRF，PGI₂等，除強烈地舒張血管平滑肌細胞、擴張血管外，也能抑制平滑肌細胞的增殖。

    3）降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）：嚴格講，CGRP并非產生于血管內皮細胞，而主要產生于神經系統。但在血管壁有肽能神經纖維，釋放肽類神經遞質，它是不依賴于內皮細胞的強烈舒血管物質，作用緩慢而持久，能抑制血管平滑肌細胞的增殖，但可促進內皮細胞的增殖。

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