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簡(jiǎn)介
土壤樣品含有大量的微生物，其中絕大部分的微生物都是無法直接培養(yǎng)進(jìn)行繁殖和研究。從土壤樣品中提取DNA 是研究土壤微生物最為有效的方法。目前從土壤樣品中提取微生物DNA 的方法主要有直接法和間接法。直接法是指把土壤樣品放在裂解液中，經(jīng)過有效的破壁方法使微生物的DNA 全部釋放到裂解液中，然后再進(jìn)行分離提取，如Zhou 的方法。間接法是指將土壤放在一種的緩沖液中，如Buffer PBS 等，把微生物從土壤中分離出來，然后再進(jìn)行DNA 的提取。間接法可大大降低土壤中腐殖酸，重金屬鹽對(duì)DNA提取帶來的影響，但是這種方法會(huì)丟失許多微生物，得到的DNA并非土壤樣品中的全基因組(宏基因組)，目前已經(jīng)很少研究者會(huì)采用這種方法。從土壤樣品中直接提取DNA 可最大可能性地獲得全基因組，但是這種方法卻面臨以下幾個(gè)問題：
1. 腐殖酸的污染。土壤中，特別是森林，草地土壤含有非常豐富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有機(jī)物分子，部分分腐殖酸同核酸分子非常類似，在純化過程中非常難于去除。微量的腐殖酸污染都會(huì)導(dǎo)致下游應(yīng)用，如PCR，酶切的失敗。
2. 裂解方法。土壤樣品中含有各種微生物，如細(xì)菌和真菌等。革蘭氏陽性細(xì)菌和真菌都含有非常厚的細(xì)菌壁，讓這些微生物的細(xì)胞壁有效破裂是提取高產(chǎn)量宏基因組DNA 的關(guān)鍵。由于土壤樣品的復(fù)雜性，使用酶法(如溶菌酶，破壁酶，蝸牛酶)或液氮研磨都不可行，因?yàn)橥寥乐泻懈鞣N金屬離子或抑制因子導(dǎo)致消化酶的活性失活，或土壤中的沙粒等會(huì)導(dǎo)致液氮研磨很難進(jìn)行。
3. DNA 得率難于控制。土壤樣品或因肥沃，或因貧瘠，或因含水量豐富，或因干枯，或因取樣的深淺度，都會(huì)造成微生物數(shù)量和品種發(fā)生劇烈改變。在一個(gè)小范圍的土壤樣品DNA 含量往往會(huì)差別成千上百倍。此外，某些土壤中含有的化學(xué)成分，如重金屬鹽，粘土物質(zhì)都會(huì)造成DNA 得率降低。Magen 公司的HiPure Soil DNA Kit 采用硅膠柱純化技術(shù)，是專門為土壤DNA 提取為設(shè)計(jì)的。該試劑盒采用玻璃珠研磨法和熱激化學(xué)破壁法，可不需特殊的珠磨儀，在渦旋儀就可進(jìn)行，適合于廣大的研究室。試劑盒中Absorber Reagent 是Magen 公司獨(dú)家開發(fā)的腐殖酸吸附劑，能高效去除各種腐殖酸的污染。此外還采用無醇的硅膠柱純化方式，可高效去除土壤中各種可溶性金屬鹽，以及其它可溶性的抑制因子。該試劑盒已經(jīng)成功地提取如下土壤(部分是客戶反饋)：自然保護(hù)區(qū)森林的土壤(長(zhǎng)達(dá)30-40 年森林土壤，表層有30-50cm 落葉層)，紅樹林土壤，草地，耕地，海底泥，污泥，礦石區(qū)泥土，有機(jī)物污染的泥土，池塘泥，垃圾泥，空調(diào)管道堆積物等。
實(shí)驗(yàn)方法
為表明該試劑盒的優(yōu)勢(shì)性，我們選擇以下不同組織樣品進(jìn)行DNA提取實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。
l 森林類樣品：自然保護(hù)區(qū)森林土壤(廣東黑石頂自然保護(hù)區(qū))和海南島紅樹林保護(hù)區(qū)
l 礦石區(qū)樣品：礦石區(qū)水底土壤(濕)和礦石區(qū)地表土壤(干)
l 耕地樣品：稻田土壤，菜地土壤
l 有機(jī)物污染地表樣品：污水溝衍泥和生活垃圾堆放區(qū)
操作方法（按HiPure Soil DNA Kit 試劑盒進(jìn)行）簡(jiǎn)單描述以下：
1. 取0.5g 土壤到2ml 勻漿管中。加入0.9ml Buffer SOL/SDS，高速渦旋5-10 分鐘裂解細(xì)菌或真菌。
2. 70oC 水浴10 分鐘進(jìn)一步裂解細(xì)菌。
3. 加入0.3ml Buffer PS 渦旋混勻；
4. 加入0.3ml Absorber Solution，渦旋混勻。
5. 13,000xg 離心5 分鐘。
6. 取上清。加入結(jié)合液混勻后上柱。
7. 洗滌柱子三次。
8. 加入適當(dāng)量的Elution Buffer 洗脫即可。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. DNA 電泳結(jié)果
取10 ul 純化的基因組DNA 上樣于0.8%瓊脂糖凝膠，80V 電泳30
分鐘，結(jié)果如下。
0.5g 森林類土壤樣品
(前兩個(gè)自然保護(hù)區(qū)森林土壤，后兩個(gè)為紅樹林土壤)
0.5g 耕地類土壤樣品
A: 水稻田土壤 , B: 玉米土壤
A: 生活垃圾堆放地 , B: 污水溝底泥
1 和3 是兩個(gè)礦石區(qū)水底土壤(濕)
2 和4 礦石區(qū)地表土壤(干)
2. DNA 純度和產(chǎn)量分析
土壤類型 A260 A280 A230 A260/A280 產(chǎn)量ug
1 0.1792 0.1041 0.1075 1.7 9
2 0.2107 0.1195 0.1257 1.8 11
3 0.1244 0.0730 0.0759 1.7 6
4 0.1477 0.0855 0.0900 1.7 7
5 0.2640 0.1739 0.2149 1.5 11
6 0.2584 0.1521 0.1579 1.7 12
7 0.0595 0.0390 0.0414 1.5 3
8 0.0190 0.0121 0.0623 1.6 1
1. 紅樹林土壤,2 .自然保護(hù)區(qū)森林土壤 3.玉米土壤, 4.水稻田土壤礦石區(qū)地表土壤(干) ,5.污水溝底泥,6.生活垃圾堆放地, 7.礦石區(qū)水底土壤(濕), 8. 礦石區(qū)水底土壤(干)
3. PCR 結(jié)果分析
各種樣品DNA 作模板，擴(kuò)增細(xì)菌16s 基因的電泳圖
M.100bp DNA Ladder,1.陰性對(duì)照 2.紅樹林土壤,3.自然保護(hù)區(qū)森林土壤 4.玉米土壤, 5.水稻田土壤礦石區(qū)地表土壤(干) ,6.污水溝底泥,7.生活垃圾堆放地, 8.礦石區(qū)水底土壤(濕), 9.礦石區(qū)水底土壤(干) 10.陽性對(duì)照,大腸桿DH5a 基因組.
產(chǎn)品信息
CAT.No Preps Prices
從小于0.5g 土壤樣品中分離DNA
D3142-02 50 1158
D3142-03 250 5490
從小于10g 的土壤樣品中分離DNA
D3143-02 10 868
D3143-03 50 4125
試劑盒的內(nèi)容：
l Buffer SOL, Buffer SDS, Buffer SP, Buffer BD, Buffer GW2,Elution Buffer, Absorber Reagent
l
HiBind DNA Mini Column, 2ml Collection Tube
l
2ml 勻漿器
常見問題分析
1. 試劑盒是如何進(jìn)行破壁的？
答: 該試劑盒采用高濃度SDS 裂解液和珠磨法進(jìn)行破壁。土壤中含有細(xì)菌和真菌，以及其它微生物。大部分革蘭氏陰性細(xì)菌在SDS裂解液中可快速發(fā)生裂解，革蘭氏陽性細(xì)菌和真菌是SDS 裂解液中是不會(huì)裂解的。采用玻璃珠高速渦旋或使用珠磨儀可有效裂解細(xì)菌和真菌。此外，試劑盒還進(jìn)行熱激(70oC 或90-95oC)步驟，以確保這些微生物的有效裂解。為了比較不同的破壁方法，我們選擇四種森林土壤(1,2,3,4)，然后采用不同的方法(A,B,C,D)進(jìn)行破壁。結(jié)果以下。結(jié)果表明，使用珠磨儀(A,C)勻漿能得到最高的產(chǎn)量，但1號(hào)樣品因沒有加熱而得不到DNA。使用手工渦旋和液氮研磨，輔助加熱都可以獲得較高產(chǎn)量的DNA。
A：Fastprep-24 珠磨儀 C: 2000 Geno/Grinder 珠磨儀
(A,C 珠磨儀結(jié)束后，沒有加熱步驟)
B: 用玻璃珠，在點(diǎn)動(dòng)渦旋儀上渦旋3 分鐘，再70oC 加熱處理;
D: 用液氮研磨，再70oC 加熱處理。(1,2: 紅樹林土壤，3,4: 森林
土壤)
2. 加熱過程對(duì)產(chǎn)量提高有多大？是選擇70oC 還是95oC 加熱？
答: 加熱過程對(duì)某些土壤是相當(dāng)關(guān)鍵的。我們的實(shí)驗(yàn)表明，某些土壤經(jīng)高效珠磨儀Fastprep-24 處理后，70oC 處理10 分鐘可提高3-4 倍的DNA 產(chǎn)量。某些土壤對(duì)加熱并不敏感。90-95oC 處理10分鐘可提高10-30% DNA 的產(chǎn)量，對(duì)一些特別難裂解的細(xì)菌(如金黃色葡萄球菌)，95oC 熱激非常重要。但是95oC 處理會(huì)引起DNA 的降解。我們建議需要檢測(cè)難裂解細(xì)菌或真菌才進(jìn)行95oC 處理。
左圖結(jié)果表明: 高溫處理(95oC)可以提高產(chǎn)量，但是會(huì)引起DNA 的降解。右圖表明，在滅菌的土壤樣品中接種金色葡萄球菌后，只有95oC 處理可能獲得其DNA。
3. 如何提高土壤DNA 的產(chǎn)量？
答：土壤樣品中所含的微生物種類，微生物的數(shù)量，以及土壤樣品中的有機(jī)，無機(jī)鹽都會(huì)直接影響到DNA 的產(chǎn)量。如下幾種方法可顯著土壤中DNA 的產(chǎn)量。
l 土壤中微生物含量低： 提高土壤用量至1-2g。提高土壤用量時(shí)，必須相應(yīng)地提高Buffer SOL, Buffer DS Buffer PS 的用量。
l 土壤中存在DNA 吸附物質(zhì)： 加入脫脂奶粉。如何土壤樣品因含有粘土，硅膠鹽等有機(jī)物，這些有機(jī)物會(huì)吸附核酸而造成DNA 產(chǎn)量過低。可以在Buffer SOL 中，加入脫脂奶粉至8-40mg/ml，以減少對(duì)核酸的吸附；
l 土壤中含有重金屬鹽：提高土壤用量至2-5g。土壤中的某些可溶性的二價(jià)或三價(jià)金屬鹽會(huì)絮凝DNA 而導(dǎo)致DNA 的損失。舉例來說，在DNA 溶液中，加入Al3+或Zn2+等離子時(shí)，DNA 就會(huì)立即同這些金屬離結(jié)合形成不溶解的物質(zhì)。處理該類型樣品時(shí)，可以在Buffer SOL 中加入特殊金屬絡(luò)合劑，如EGTA 等。(Buffer SOL 中已含有高濃度的EDTA)。或提高土壤用量。
4. 為什么DNA 電泳拖尾嚴(yán)重？
答： 這是由于DNA 降解形成的。造成DNA 降解的原因有如下幾點(diǎn)：
1) 土壤中含有豐富小型生物和易裂解的細(xì)菌。這些易裂解的小型生物和細(xì)菌在玻璃珠長(zhǎng)時(shí)間渦旋中就會(huì)造成DNA 降解。解決方案就是減少渦旋時(shí)間，或用高能量的珠磨儀代替手工渦旋。(高能量的珠磨儀能提供非常高的能量，在短時(shí)間就可以達(dá)到破壁效果，因而能減少DNA 的降解)
2) 樣品中存在某些化學(xué)物質(zhì)，或樣品在貯藏過程中發(fā)生降解。
5. 加入異丙醇沉淀時(shí)，為什么會(huì)形成一大堆沉淀？
答：土壤樣品含有各種無機(jī)或有機(jī)分子，其它大部分的無機(jī)分子，如金屬鹽都是水溶性的。加入異丙醇沉淀時(shí)，水溶性金屬鹽的溶解度下降就會(huì)析出形成沉淀物。處理礦石區(qū)的樣品時(shí)常常會(huì)碰到這種現(xiàn)象。使用該試劑盒時(shí)可去除這些水溶性金屬鹽的污染。
6. Absorber Reagent 去除腐殖酸的原理和效果？
答：Absorber Reagent 是pH 依賴性的腐殖酸吸附劑。 該吸附劑在pH8.0 的緩沖液中能高效特異性地吸附腐殖酸。AbsorberReagent 吸附劑在pH7.0 以下，也會(huì)吸附核酸DNA。因此，DNA必須采用Elution Buffer 或Buffer TE(Ph8.0)來溶解。
(處理前)
(Absorber Reagent 處理后)
由圖可知，在Absorber Reagent 處理，粗制的土壤DNA 中含有大量的腐殖酸的污染，顏色很深；Absorber Reagent 處理后，DNA的顏色消失了，表明腐殖酸已經(jīng)被去除。
7. 該試劑盒還可以通過何種方法進(jìn)行優(yōu)化?
答： 由于土壤樣品百差萬別，不同的土壤樣品對(duì)預(yù)處理的方式都有不同的效果。試劑盒采用SDS 裂解液和玻璃珠研磨對(duì)土壤樣品進(jìn)行裂解和預(yù)處理，這種方案可能對(duì)某些樣品是沒有效果。此時(shí)，用戶可按自已的方案或其它方案對(duì)土壤的DNA 進(jìn)行粗提取，然后再按試劑盒的第9 步，加入HTR Reagent 吸附去除腐殖酸，過柱進(jìn)一步純化。
8． HTR Reagent 處理后，DNA 樣品顏色還是很深？或使用該試劑盒得到的DNA 還是有顏色的，怎么辦？
答： 這種樣品往往是森林土壤，特別落葉層很厚的土壤。這種土壤因落葉的分解而積累豐富的腐殖酸。HTR Reagent 吸附腐殖酸有一定的飽和度，過多的腐殖酸就會(huì)殘留。可重復(fù)一次HTR Reagnet的吸附步驟。
9． Absorber Reagent 處理后，DNA 樣品顏色還是很深？或使用該試劑盒得到的DNA 還是有顏色的，怎么辦？
答： 這種樣品往往是森林土壤，特別落葉層很厚的土壤。這種土壤因落葉的分解而積累豐富的腐殖酸。Absorber Reagent 吸附腐殖酸有一定的飽和度，過多的腐殖酸就會(huì)殘留。可重復(fù)一次Absorber Reagent 的吸附步驟。
10． 該方法可以獲得所有微生物的DNA 嗎？
答： 不一定。土壤樣品中含有大量的微生物，有細(xì)菌和真菌，以及其它植物根系，小型生物。某些真菌類，特別孢子類真菌，因帶有非常厚的細(xì)胞壁，無法破壁而導(dǎo)致其DNA 的丟失。若需要提取這些難提取微生物的DNA 時(shí)，我們建議加強(qiáng)破壁的強(qiáng)度和時(shí)間。
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