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胚胎干細胞培養(yǎng)標準化操作規(guī)程 6/28/01
目錄
一、細胞
二、一般培養(yǎng)-保持胚胎干細胞處于未分化狀態(tài)
培養(yǎng)基
細胞復蘇
凍存細胞
明膠包被
細胞傳代
三、體外分化
培養(yǎng)基
包被有多聚鳥氨酸/纖維結(jié)合蛋白的培養(yǎng)板（使用或不使用蓋玻片）
體外分化方法
四、移植細胞的準備
細胞
多能性胚胎干細胞產(chǎn)生于小鼠胚泡
1．表達綠色熒光蛋白（EGFP）的B5-ES細胞。由Dr. Nagy的實驗室制備。
2．D3-ATCC; CRL-1934. 我們得到時大約傳了17代。
3．J1-由Dr. Jaenish的實驗室友情提供。我們得到時大約傳了7－9代。
4．J1rtTA-rtTA表達J1細胞，由Dr. Jaenish的實驗室友情提供。
5．表達黃色熒光蛋白的YC5-ES細胞，由Dr. Nagy的實驗室提供。
一般培養(yǎng)--維持ES細胞處于未分化狀態(tài)
ES細胞培養(yǎng)用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培養(yǎng)基來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細胞的基質(zhì)。建議每2－3天從達到80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細胞一次，細胞傳代以后，在將細胞接種在0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過預先將細胞接種在沒有經(jīng)過包被的組織培養(yǎng)板2個小時，使分化細胞粘附，從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃，5％CO2，100％濕度條件下培養(yǎng)。
培養(yǎng)基
ES:
配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見下文）。分裝在50ml FALCON管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。
貯存液
DMEM(高糖)
馬血清（HS）
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巰基乙醇（55Mm）
PEST
ESGRO
復蘇細胞
細胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結(jié)晶的形成，結(jié)晶的形成會損害細胞。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性，快速的進行細胞復蘇是很重要的。
步驟：
1．從液氮中取出一管細胞；
2．將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內(nèi)溶液恰好完全溶解）；
3．將細胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）；
5．離心3分鐘；
6．棄上清，用2ml ES培養(yǎng)基重懸細胞，至少吹打10次；
7．接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿；
8．孵育。
凍存細胞
凍存液
90％HS和10％二甲基亞砜
步驟：
1．1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi)；
2．用細胞刮刀收集細胞；
3．將細胞轉(zhuǎn)入15ml Falcon管內(nèi)并離心3分鐘；
4．棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中（10cm的培養(yǎng)皿用2ml，15cm的培養(yǎng)皿用6－7ml。）
5．分裝于凍存管內(nèi)，每管1ml；
6．置－80℃過夜，第二天移入液氮。
明膠包被
準備500ml 0.1％明膠溶液
1．將0.5g明膠溶解在500ml無鈣鎂的PBS中（50－65℃水浴15～30分鐘）。
2．最好在溶液沒有冷卻的情況下通過0.2μm濾膜過濾，貯存在4℃。
包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
1．加入足量的明膠溶液覆蓋培養(yǎng)平面（15cm培養(yǎng)皿加2ml，10cm培養(yǎng)皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆蓋培養(yǎng)表面就行了。）；
2．置室溫30分鐘；
3．去除明膠溶液，將培養(yǎng)板貯存在包裝袋中室溫放置，最好將板子平方，以免明膠污染蓋子和流出培養(yǎng)板。
細胞傳代
建議每2－3天傳代細胞一次，過度生長的細胞會降低細胞的自然分化率，我們建立了一種純化方法來去除分化細胞，在將細胞接種在明膠包被的培養(yǎng)板上之前，通過將分化細胞黏附在沒有包被的組織培養(yǎng)板上去除分化細胞。純化步驟包含在下面的方法中。
1．去除培養(yǎng)液；
2．1×無鈣鎂PBS洗滌；
3．加入1×胰酶EDTA(10×胰酶EDTA用PBS稀釋。)37℃孵育5分鐘。
4．加入ES培養(yǎng)基使胰酶失活；
5．將細胞轉(zhuǎn)入15ml離心管中離心3min；
6．去除上清，將細胞重懸于2mlES培養(yǎng)基，至少吹打10－20次。
如果加入培養(yǎng)基的量較少會比較容易將細胞團弄散分開。ES細胞有聚集成團的傾向，傳代過程中仔細將細胞弄散分開很重要。這樣可能會減少細胞的自然分化。
7．將細胞接種在沒有包被的組織培養(yǎng)皿中（使用和一開始同樣規(guī)格的培養(yǎng)皿）放入溫箱2小時（分化細胞在該時間內(nèi)將黏附，而ES細胞仍將保持懸浮）；
8．將含有細胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入明膠包被（見下文）的組織培養(yǎng)皿。吹打以確保細胞被分散開（前面已經(jīng)提到--ES細胞有聚集成團的傾向）
9．建議按1：4－1：10的比率傳代(ATCC)
保持細胞的傳代比率很重要，以我們的經(jīng)驗，1：8的比率是好的，可以使細胞的自然分化降到最低。當你使用不同規(guī)格的培養(yǎng)板進行細胞傳代可以使用表1來計算傳代比率。
體外分化
多能胚胎干細胞在體內(nèi)外可以分化為各種類型的細胞。我們的體外分化方法有利于神經(jīng)前體細胞通過在最少量的培養(yǎng)基內(nèi)選擇（第3步），在有bFGF存在的情況下擴增（第4步）并最終分化在第5步。細胞全程培養(yǎng)在37℃，5％CO2，100％濕度條件下。
時間線（總時間為27～34天）
第2步；4＋1天 第3步；4－10天 第4步；4天 第5步；10－15天
培養(yǎng)基
EB
配制一20×不含DMEM，F(xiàn)BS，ESGRO的溶液（該溶液也能用于ES培養(yǎng)基--見前述）。分裝在50ml FALCON管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。將21ml該溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。
貯存液
DMEM(高糖)
胎牛血清
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巰基乙醇（55Mm）
PEST（P104U/mlS104μg/ml
ITSFn and N3：
配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分裝在15ml FALCON管中，（稀釋為1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm濾膜過濾，貯存在-20℃。將該溶液加入DMEM/F12中制備培養(yǎng)基，貯存于4℃。
貯存液
DMEM(高糖)
轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/ml
胰島素5mg/ml
亞硒酸鈉300μM
黃體酮（20μM）
腐胺（100μM）
PEST（P104U/ml S104μg/ml）
層粘連蛋白100μg/ml
纖維連接蛋白250μg/ml
堿性rhFGF, 10μg/ml
*在第4步將bFGF加入N3培養(yǎng)基使終濃度為10ng/ml。
ITSFn and N3培養(yǎng)基貯存液的準備
使用無菌的溶劑和稀釋液，在分裝之前要對溶液進行過濾，如果因為某些原因溶液在分裝之前沒有進行過濾，需要在管子上標明以便別人在使用時知道該溶液不能直接用于細胞培養(yǎng)。
貯存液 溶劑，貯存液，稀釋劑和儲存
轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/ml
胰島素5mg/ml
亞硒酸鈉300μM
黃體酮（20μM）
腐胺（100μM）
PEST（P104U/ml S104μg/ml）
層粘連蛋白（100μg/ml）
纖維連接蛋白（250μg/ml ）
堿性rhFGF, （10μg/ml）
包被有多聚鳥氨酸/纖維結(jié)合蛋白的培養(yǎng)板（使用或不使用蓋玻片）
包被液的準備
多聚-L-鳥氨酸，15μg/ml
把75ml多聚-L-鳥氨酸和425ml 1×PBS混合。貯存在4℃。
纖維結(jié)合蛋白，1μg/ml
把0.5ml纖維結(jié)合蛋白和500ml 1×PBS混合。
包被過程：
1．加入多聚-L-鳥氨酸，至少2－3小時（過夜也行）
2．吸出多聚-L-鳥氨酸
3．加入纖維結(jié)合蛋白，大約1－2小時
4．吸出纖維結(jié)合蛋白，放置30分鐘晾干
5．貯存在4℃
24孔板用200μl，6孔板用500μl。震蕩培養(yǎng)板確保溶液能夠覆蓋蓋玻片或培養(yǎng)孔。有時需要劇烈震蕩培養(yǎng)板。
體外分化方法
第1步：ES培養(yǎng)基
在LIF（ESGRO）存在的條件下維持細胞培養(yǎng)
第2步：EB培養(yǎng)基
使用細菌培養(yǎng)皿去除LIF后胚狀體的形成需要4天。
1．分散純化細胞（參見上面的細胞傳代部分）
2．純化2小時后將細胞轉(zhuǎn)入含有ES培養(yǎng)基的50ml Falcon管中，計數(shù)細胞取適量體積放入15ml管中離心3分鐘。
3．用2mlEB培養(yǎng)基重懸細胞，吹打至少10次制成單細胞懸液
4．一個15cm的細菌培養(yǎng)皿接種4～5×106個細胞（1個完全融合的組織培養(yǎng)皿通常足以接種4個同樣規(guī)格的細菌培養(yǎng)皿）。
5．2天后更換培養(yǎng)基
將胚狀體轉(zhuǎn)入錐形管中放置3～5分鐘使細胞沉降。棄去上清，將細胞重懸于新鮮培養(yǎng)基并接種在新的細菌培養(yǎng)皿中。
6．用EB培養(yǎng)基培養(yǎng)的第4天將細胞轉(zhuǎn)入沒有包被的組織培養(yǎng)皿中（這即是細胞的移植步驟）。1個組織培養(yǎng)皿之中放置1個細菌培養(yǎng)皿，在進行第3步之前一天將胚狀體黏附在同樣規(guī)格的培養(yǎng)板上。
形成胚狀體需要4天時間。在EB培養(yǎng)基中再培養(yǎng)1天使胚狀體粘附在組織培養(yǎng)皿的表面。這一天被認為是第2步和第3步的分界。
第3步--ITSFn培養(yǎng)基
在最少量培養(yǎng)基中選擇神經(jīng)前體細胞
1．在胚狀體接種在組織培養(yǎng)皿一天后將培養(yǎng)基換成ITSFn培養(yǎng)基
2．并非所有胚狀體在這一時期都已經(jīng)發(fā)生粘附，因此在移除培養(yǎng)基時要小心謹慎以使大部分胚狀體留在培養(yǎng)皿內(nèi)。
3．保持細胞在ITSFn中培養(yǎng)大約10天，根據(jù)需要更換培養(yǎng)基--大約每隔一天。
觀察細胞形態(tài)，神經(jīng)樣細胞大約出現(xiàn)在第4到第7天。當神經(jīng)樣細胞能夠被鑒別時，轉(zhuǎn)入到第4步。步驟的轉(zhuǎn)換應該在神經(jīng)前體細胞出現(xiàn)第一個清晰的標志幾天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
第4步－N3培養(yǎng)基＋bFGF
通過將神經(jīng)前體細胞培養(yǎng)在含有10ng/ml bFGF的培養(yǎng)基中進行擴增。
1.PBS洗滌，加入2ml 1×胰酶（1個15cm的培養(yǎng)皿所需胰酶的量根據(jù)前文表中的體積）（10×胰酶EDTA用PBS稀釋）
2．37℃孵育5分鐘
3．用4mlEB培養(yǎng)基終止胰酶活性，將細胞轉(zhuǎn)入錐形管中放置3～5分鐘移出細胞團，將上清移入一新的離心管離心。
4．將細胞重懸于含有bFGF的N3培養(yǎng)基。
5．將細胞接種在包被多聚-L-鳥氨酸/纖維連接蛋白的蓋玻片上（最好將蓋玻片放于24孔培養(yǎng)板或6孔培養(yǎng)板，6孔培養(yǎng)板中每孔放置5個蓋玻片如果是塑料的放置4個，以使最大可能的獲得樣品數(shù)量）。24孔板接種3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。
6．2天后更換培養(yǎng)基
第5步－N3培養(yǎng)基
通過撤除bFGF使神經(jīng)前體細胞分化
1．細胞被接種在蓋玻片上4天后將培養(yǎng)基換成不含bFGF的N3培養(yǎng)基
2．根據(jù)需要換液（大約每隔一天）
3．分化10～15天后固定細胞
移除培養(yǎng)基
PBS洗滌
加入4%福爾馬林
室溫放置30分鐘
PBS洗滌2次
儲存于PBS。長期儲存使用含0.01％疊氮化納的PBS
移植細胞的準備
細胞在胚狀體形成4天以后被移植（相應于體外分化過程中的第2步末細胞被轉(zhuǎn)種到組織培養(yǎng)板）。正如在前文體外分化中所描述的在移植之前4天開始形成胚狀體。通常再需要一天時間以便將胚狀體移植入一10cm的培養(yǎng)皿。
移植
1．將胚狀體轉(zhuǎn)移至一15ml 圓錐形管中放置3～5分鐘使胚狀體沉降下來。
細胞被離心3分鐘會更好。放置使之沉降將會去除更多的單個細胞（包括死細胞）而這些細胞可以被離心下來。
2．去除上清將胚狀體重懸于無鈣鎂離子的1×PBS中
3．離心3分鐘
4．去除上清加入1×胰酶（10cm的培養(yǎng)皿加1ml）
5．37℃水浴5分鐘
6．加入5mlEB培養(yǎng)基小心吹打約10次
小心處理細胞很重要，進行細胞傳代分散細胞時不可劇烈吹打。
7．離心2分鐘
8．吸出上清將細胞重懸于500μl EB培養(yǎng)基
9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
10．離心2次
11．吸出上清將細胞重懸于100μl EB培養(yǎng)基
煙酸己可堿標記ES細胞進行移植
1．準備一10μg/ml的煙酸已可堿染液（雙苯酰亞胺，在冷凍室118）
2．加入1mg（你能稱到的最小量）到5ml EB培養(yǎng)基（制成200μg/ml）
3．將溶液稀釋成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培養(yǎng)基）
4．如前所述將細胞重懸于2ml煙酸已可堿染液而不是EB培養(yǎng)基中制備ES細胞懸液，
5．將懸液置于室溫（或冰上）30分鐘
6．離心2分鐘
7．吸出上清將細胞重懸于2ml EB培養(yǎng)基
8．重復一次
9．離心2分鐘
10．吸出上清將細胞重懸于100μl EB培養(yǎng)基并置于冰上。
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