細胞培養(yǎng)基的種類繁多，細胞培養(yǎng)方式也較多，如何正確地使用培養(yǎng)基及最大程度地保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)以維持細胞的生長，對每個細胞培養(yǎng)工作者都很重要。培養(yǎng)基的使用依據(jù)不同的培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)方式、細胞種類的不同而存在差異。

1、細胞培養(yǎng)液的構(gòu)成

細胞培養(yǎng)液指細胞生長的液體環(huán)境，一般指完全培養(yǎng)液，添加了血清、水解乳蛋白、各種添加劑等可以直接使用的培養(yǎng)液。

1.1 細胞培養(yǎng)基&血清模式

血清對于在傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方中生長和增殖的大多數(shù)細胞系來說是需要的，因為大多數(shù)單獨的培養(yǎng)基并不能提供細胞生長所需要的全部營養(yǎng)，如MEM培養(yǎng)基，較為常用的量為5%～10%的比例，而特殊的低血清培養(yǎng)基血清量可降至3%左右，細胞的形態(tài)和功能不受影響。

圖1 BHK21-13第14代，MEM SLM培養(yǎng)基(SLM120)+3%NBS，100×

注：SLM120為清大天一公司低血清培養(yǎng)基，上圖為培養(yǎng)24小時細胞密度，下圖為48小時細胞密度。

血清可在培養(yǎng)基滅菌后加入，也可與培養(yǎng)基混合后一起過濾。血清的添加一方面補充了細胞生長、增殖所需的一些因子(如生長因子等)，另一方面也增加了培養(yǎng)基的黏滯度，這樣可以降低細胞在懸浮培養(yǎng)中或被胰蛋白酶消化后的損傷。

但是血清的加入也帶來了很多問題，血清都是批量生產(chǎn)，各批之間差異很大，血清含一些對細胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶、補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。血清的使用使得實驗和生產(chǎn)的標準化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。血清質(zhì)量問題還會對接種病毒以及毒價產(chǎn)生影響，例產(chǎn)毒少，毒價低。

1.2 細胞培養(yǎng)基&乳歐液模式

化學合成培養(yǎng)基現(xiàn)雖已大規(guī)模使用，但在某些培養(yǎng)領(lǐng)域水解乳蛋白(Lactalbumin Hydrolysate )仍在使用，以補充培養(yǎng)液中缺乏的氨基酸、小肽物質(zhì)。較為常用的方式是用漢氏(Hank's BSS)或歐式(Earle's BSS)平衡鹽溶液溶解水解乳蛋白(一般為5‰濃度)，即成乳漢(歐)液，再與化學合成培養(yǎng)基(一般為MEM)按比例混合使用(如1：1)。

水解乳蛋白為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸。既可用于細菌微生物培養(yǎng)，又可用于動物細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)中一般為0.5%水解乳蛋白(經(jīng)平衡鹽溶解)與合成培養(yǎng)基(如MEM)按1：1混合使用。目前在生產(chǎn)中主要用于地鼠腎細胞等細胞的培養(yǎng)和維持。但是水解乳蛋白的使用也給生物制品的生產(chǎn)帶來一定的風險。首先由于水解乳蛋白來源于動物，有可能攜帶傳染源，包括病毒和有毒物質(zhì)。任何一種傳染源都可能對正在生長的細胞系或者制品帶來風險。其次水解乳蛋白及含有動物組分培養(yǎng)基的使用，使生物制品下游處理變得復雜，這對于蛋白質(zhì)藥物顯得更加重要。因為用動物細胞生產(chǎn)生物藥品，其面臨的最大困難就是如何去除內(nèi)源或同源蛋白。不確定的成分，例如動物肽類物質(zhì)的引入，勢必會增加提取、分離、純化步驟，一方面使成本提高，另一方面也會影響生物制品的產(chǎn)量和質(zhì)量。

1.3 細胞培養(yǎng)基&各類添加劑(生長因子等)模式

成分復雜的培養(yǎng)基還含有許多化合物，包括蛋白質(zhì)、多肽、核苷、檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物、丙酮酸及脂類等。已發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)基中的血清濃度減少時，這些成分都是必需的。既使在使用血清的情況下，這些成分也可幫助細胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細胞系的生長。

激素和生長因子在大多數(shù)常規(guī)培養(yǎng)基的配方中都沒有注明，但在無血清培養(yǎng)基中通常要加入它們，用其來代替血清中的激素(包括50ng/ml的生長激素和1～10U/ml的胰島素)，它們能增加多種不同類型細胞的貼瓶率;氫化可的松能提高膠質(zhì)細胞、成纖維細胞的克隆形成率。生長因子包括FGF家族、EGF、PDGF、IGF-1和IGF-2及白介素等，生長因子和細胞因子有著廣泛的特異性，一般與激素或其它物質(zhì)起相互協(xié)同或加成作用。

另一種常見的添加物就是血清替代物，目前已有許多可完全或部分替代傳統(tǒng)培養(yǎng)液中血清成分的商業(yè)產(chǎn)品，其穩(wěn)定性較好，但批次間仍有差別，產(chǎn)品的成分也不很確定。

2、細胞培養(yǎng)基配制

2.1 干粉培養(yǎng)基原倍液的配制

1)配制過濾除菌的細胞培養(yǎng)基

1)閱讀培養(yǎng)基使用說明，確定需要添加何種添加劑(如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等)。

2)根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水(20℃～30℃)將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95%，輕微攪拌溶解。

3)加入規(guī)定量的碳酸氫鈉及所要添加的物質(zhì)。

4)輕微攪拌溶解，加注射用水至規(guī)定體積。

5)用1mol/L 氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。

6)用0.22μm濾膜正壓過濾除菌。

7)溶液應在2℃～8℃下避光保存。

具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書。

(2) 配制可高壓滅菌細胞培養(yǎng)基

1)根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水(20℃～30℃)將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95%，輕微攪拌溶解。

2) 在121℃、15psi下滅菌15分鐘。

3) 待溶液冷卻至室溫，加入無菌0.2mol/L L-谷氨酰胺溶液規(guī)定體積、無菌7.5%(w/v)碳酸氫鈉溶液規(guī)定體積，加注射用水(20℃～30℃)至規(guī)定體積，混勻。

4) 如果必要，用1mol/L 氫氧化鈉溶液或1mol / L鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。

5) 溶液應在2℃～8℃下避光保存。

具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書。

3 注意事項

(1) 細胞培養(yǎng)用水一般為三蒸水(經(jīng)石英蒸餾器蒸餾)或超純水，醫(yī)藥生產(chǎn)上一般為注射用水。

(2) 建議盡量選擇與所用量相匹配的包裝一次使用，因為包裝一旦打開，組分可能會變質(zhì)或因受潮而結(jié)團。

(3) 溶解干粉培養(yǎng)基時先加入終體積90%～95%的培養(yǎng)用水，添加劑加完后再補足。

(4) 如需添加的組分較多時，某一組分完全溶解后，再添加另一組分。

(5) 待培養(yǎng)基完全溶解后再加入碳酸氫鈉，以免產(chǎn)生沉淀。

(6) 所有成分完全溶解后，培養(yǎng)基應立即過濾或高壓除菌，以免產(chǎn)生沉淀或有微生物污染。

(7) 由于除菌過濾后，pH值可能會升高0.1～0.2個單位，因此在過濾前，可將pH調(diào)至比所需值低0.1～0.2個單位。

(8) 在細胞培養(yǎng)過程中，建議不加或加少量的抗生素，如血清的濃度較低則所加抗生素的量也要相應降低一些。

(9) 建議用1N HCl或1N NaOH來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，因為用碳酸氫鈉調(diào)pH值對培養(yǎng)液的滲透壓影響比較大。如下圖所示：

圖2 MEM SLM(SLM120)在相同pH值時所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對應的培養(yǎng)液滲透壓

圖3 199(MD502)在相同pH值所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對應的培養(yǎng)液滲透壓

4、滅菌方法

培養(yǎng)基的滅菌方法主要有兩種，高壓除菌及0.22um微孔濾膜過濾除菌。與過濾相比，高壓滅菌的工作強度小，成本較低，但易造成營養(yǎng)成分的流失，而且在多次加樣(無菌谷氨酰胺溶液，無菌碳酸氫鈉溶液等)過程中容易造成二次污染。大多數(shù)培養(yǎng)基采用0.1～0.2μm孔徑的微孔濾膜進行過濾滅菌，并且已成為培養(yǎng)基除菌的發(fā)展方向，它可低限度地減少培養(yǎng)基的營養(yǎng)損失。

4.1 高壓滅菌

某些培養(yǎng)基(如MEM)可進行高壓滅菌，例如清大天一的MEM培養(yǎng)基中的MD605、MD609等。這類培養(yǎng)基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，一般是在培養(yǎng)基高壓滅菌后加入L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉的無菌的液體。另外可高壓的谷氨酸鹽(如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)可代替L-谷氨酰胺。

可高壓滅菌的培養(yǎng)基在121℃、15psi，15分鐘的條件下完全可達到滅菌效果及營養(yǎng)成分的最小損失，不需將滅菌時間延長。為保證高壓滅菌的效果，滅菌設(shè)備的驗證很關(guān)鍵。

4.2 過濾滅菌

可供過濾滅菌使用的濾膜很多，其材料多為polyethersulphone(PES)、尼龍、多聚碳酸鹽、醋酸纖維素、硝酸纖維素、PTFE、陶瓷等。一般情況下采取正壓過濾，正壓過濾較之負壓過濾具有流速高、過濾快、不易污染，可避免蛋白質(zhì)產(chǎn)生大量氣泡等優(yōu)點。一般使用過濾器可參照各供應商的產(chǎn)品說明書。

目前大多數(shù)實驗室和制藥企業(yè)采用微孔濾膜濾器(如Zeiss濾器)或立式微孔濾器(Millipore、Pall)除菌。微孔濾膜濾器為不銹鋼，中間可夾放0.22um濾膜。使用這種濾器最重要步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。如在使用Zeiss濾器時，先要用培養(yǎng)用水將濾膜充分潤濕，在安裝濾膜時可在其上放置一層定性濾紙再固定。消毒時旋鈕不要扭太緊，凡與空氣接觸部位都要包好(可用牛皮紙、紗布、無紡布等);高壓滅菌后，在無菌環(huán)境中立即將旋鈕扭緊。過濾除菌結(jié)束后，要打開濾器，檢查濾膜是否完整，如果濾膜破裂，需重新進行過濾除菌過程。立式微孔濾器可以選用不同的微孔濾柱體積，因為濾膜的折疊，膜面積顯著增大，液體處理量大，而且不容易發(fā)生堵塞現(xiàn)象。

5、細胞培養(yǎng)液的儲存

細胞培養(yǎng)液的儲存條件一般為2～8℃、密閉、避光保存，但要注意如下幾點：

(1) 過濾后的完全培養(yǎng)液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培養(yǎng)液要盡快使用，一般在2～3周內(nèi)使用完。

(2) 滅菌后的未加L-谷氨酰胺等添加劑的培養(yǎng)基溶液，一般可在4℃保存6～9個月，也可冷凍保存,用時解凍。

(3) 高壓除菌后的培養(yǎng)基應置4℃保存，不能因為其可耐受高溫而忽略儲存溫度。

(4) 添加了谷氨酰胺的培養(yǎng)液放置2周后，要補加和原來同樣量的谷氨酰胺，但這樣并不能消除谷氨酰胺降解產(chǎn)生的游離氨，建議配制好的培養(yǎng)液盡快使用。

圖4 pH為7.6時不同溫度2mM谷氨酰胺的穩(wěn)定性

圖 5 室溫下不同pH時10mM谷氨酰胺的穩(wěn)定性

(5) 添加某些生長因子、激素等添加物，可能會改變培養(yǎng)液的儲存條件，比如溫度、時間等方面的要求。

細胞培養(yǎng)基從1903年開始發(fā)展到現(xiàn)在，有199、MEM、DMEM、RPMI1640等基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基，還有低血清細胞培養(yǎng)基、無血清細胞培養(yǎng)基甚至無蛋白培養(yǎng)基，種類繁多、各具特點。在使用過程中，只有根據(jù)各類細胞培養(yǎng)基的特性、特點正確的選擇配制方法、滅菌方法、儲存方法，才能最大程度地保持細胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)，發(fā)揮細胞培養(yǎng)基的功效。

購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 www.adsraven.com