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lonza 無(wú)血清 培養(yǎng)基 網(wǎng)址鏈接http://bitebo.com/a/gb2312/gongsixinxi/shichanghuodong/2013/0331/5024.html
一、 細(xì)胞培養(yǎng)基的概念和原理 細(xì)胞培養(yǎng)基是人工模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，是提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。培養(yǎng)液或培養(yǎng)基的含義幾乎相同，英文都是medium。當(dāng)它是粉劑時(shí)，傾向性地稱為培養(yǎng)基，而將粉劑配成液體后，多稱為培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中常常補(bǔ)加血清、抗生素等成分。培養(yǎng)基主要包括天然細(xì)胞培養(yǎng)基、合成細(xì)胞培養(yǎng)基和無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基等。
天然細(xì)胞培養(yǎng)基是人們?cè)缙诓捎玫募?xì)胞培養(yǎng)基，直接取自于動(dòng)物組織提取液或體液，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，但成分復(fù)雜，差異大、不穩(wěn)定，來(lái)源也受到限制。水解乳蛋白和膠原是兩種較好的天然培養(yǎng)基，富含氨基酸。血清是天然培養(yǎng)基中最有效和最常用的培養(yǎng)基，但其組成成分復(fù)雜，其中一些成分與功能不明確。血清的來(lái)源有胎牛血清、小?；虺膳Ｑ?、馬血清、雞血清、羊血清及人血清，最廣泛應(yīng)用的為胎牛血清和小牛血清。
合成細(xì)胞培養(yǎng)基是用化學(xué)成分明確的試劑配制的培養(yǎng)基，組分穩(wěn)定，主要包括糖類、必需氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽類等。自1950 年199 細(xì)胞培養(yǎng)基問(wèn)世以來(lái)，合成細(xì)胞培養(yǎng)基發(fā)展至今已有幾十種，除了沿用半個(gè)世紀(jì)的基礎(chǔ)合成細(xì)胞培養(yǎng)基之外，近年來(lái)還出現(xiàn)了營(yíng)養(yǎng)成分更加豐富的低血清細(xì)胞培養(yǎng)基。由于細(xì)胞種類和培養(yǎng)條件不同，適宜的合成細(xì)胞培養(yǎng)基也不同，在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最常用基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基有6～7 種，如BME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI1640、199 等。由于天然培養(yǎng)基的一些營(yíng)養(yǎng)成分不能被合成細(xì)胞培養(yǎng)基完全代替，因此一般需在合成細(xì)胞培養(yǎng)基中添加5％～10％的小牛血清。小牛血清的加入對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)非常有效，但小牛血清的成分復(fù)雜，這對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)物的分離純化和檢測(cè)會(huì)帶來(lái)一定的不便，為減少小牛血清的影響，開(kāi)發(fā)了營(yíng)養(yǎng)成分更加豐富的低血清細(xì)胞培養(yǎng)基，可以將小牛血清的使用量降低到1～3％。
無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基（serum free medium， SFM）是指在使用中無(wú)需添加血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，且其組成成分不含有任何動(dòng)物組分。按照其組分分類，還可以分為無(wú)動(dòng)物組分無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基和化學(xué)限定無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基，前者組分中可能含有某些植物來(lái)源成分，而后者完全由化學(xué)成分明確的組分組成。其中，無(wú)動(dòng)物組分無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基是目前在生物制藥行業(yè)中應(yīng)用最廣泛的，它提高了細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量，避免了使用血清帶來(lái)的麻煩。目前，已有多種無(wú)血清培養(yǎng)基上市，如雜交瘤細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基、CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基、Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基和NS0 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基等。無(wú)血清培養(yǎng)基通常添加生長(zhǎng)附加成分，如激素與生長(zhǎng)因子、低分子營(yíng)養(yǎng)成分和轉(zhuǎn)鐵蛋白等促細(xì)胞生長(zhǎng)的附加成分，一般包括胰島素、孕酮、硒酸鈉、腐胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。
細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)，它為動(dòng)物細(xì)胞的健康快速成長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。所以只要用到細(xì)胞來(lái)制造生物技術(shù)產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)基的重要作用就無(wú)可替代。 二、細(xì)胞培養(yǎng)基的種類與基本成分 2.1 天然培養(yǎng)基
天然培養(yǎng)基是指來(lái)自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過(guò)程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸被合成培養(yǎng)基所替代。
2.1.1 小牛血清
用于細(xì)胞培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細(xì)胞的原因主要是來(lái)源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)用考驗(yàn)人們對(duì)其有比較深入的理解。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。小牛血清取自出生10～30 天的小牛；新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛；胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)最高的，因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分最少。牛血清對(duì)絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細(xì)胞時(shí)使用其他動(dòng)物血清更合適。牛血清中含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。
1) 血清主要作用
(1) 提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，是細(xì)胞生長(zhǎng)必須的物質(zhì)。
(2) 提供激素和各種生長(zhǎng)因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素（氫化可的松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血小板生長(zhǎng)因子等。
(3) 提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過(guò)程中起重要作用。
(4) 提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷，對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用。
2) 優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)
血清是非常復(fù)雜的混合物，成分多樣，含有各種生理平衡的分子量差別很大的生物分子，有的對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，如含有攜帶激素、礦物質(zhì)、微量元素和脂類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。血清能夠提供細(xì)胞貼壁因子和擴(kuò)散因子。血清中含有起穩(wěn)定作用和解毒的因子，能夠維持培養(yǎng)基的pH 值并抑制蛋白酶直接或間接的酶解。但是血清的加入也帶來(lái)了很多問(wèn)題：
(1) 血清的成份可能有幾百種之多，目前對(duì)其準(zhǔn)確的成份、含量及其作用機(jī)制仍不清楚，尤其是對(duì)其中一些多肽類生長(zhǎng)因子、激素和脂類等尚未充分認(rèn)識(shí)，這給研究工作帶來(lái)許多困難；
(2) 血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化和連續(xù)性受到限制；
(3) 不能排除血清中含有易變物質(zhì)，這被認(rèn)為是“瓶中惡化”的原因之一。
(4) 對(duì)大多數(shù)細(xì)胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過(guò)程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進(jìn)某些細(xì)胞的生長(zhǎng)（成纖維細(xì)胞）同時(shí)抑制另一類細(xì)胞生長(zhǎng)（表皮細(xì)胞）。
(5) 血清含一些對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來(lái)自高度繁殖細(xì)胞的多胺反應(yīng)（如精胺、亞精胺）形成有細(xì)胞毒性作用的聚精胺。補(bǔ)體、抗體、細(xì)菌毒素等都會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至造成細(xì)胞死亡。
(6) 取材中可能帶入支原體、病毒，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響。
(7) 血清的使用使得實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。
(8) 大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來(lái)源越來(lái)越困難，價(jià)格昂貴，是構(gòu)成生產(chǎn)成本的主要部分之一。
(9) 為了使與傳染源相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)減少到最低，存在多個(gè)國(guó)家間限制進(jìn)出口生物材料的國(guó)際法規(guī)。
2.1.2 水解乳蛋白
水解乳蛋白（Lactalbumin Hydrolysate ）為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸。既可用于細(xì)菌微生物培養(yǎng)，又可用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)中一般為0.5％水解乳蛋白（經(jīng)平衡鹽溶解）與合成培養(yǎng)基（如MEM）按1:1混合使用。目前在生產(chǎn)中主要用于低鼠腎細(xì)胞等細(xì)胞的培養(yǎng)和維持。但是水解乳蛋白的使用也給生物制品的生產(chǎn)帶來(lái)一定的風(fēng)險(xiǎn)。首先由于水解乳蛋白系或者制品帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。其次水解乳蛋白及含有動(dòng)物組分培養(yǎng)基的使用，使生物制品下游處理變得復(fù)雜，這對(duì)于蛋白質(zhì)藥物顯得更加重要。因?yàn)閺膭?dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)生物藥品，其面臨的最大困難就是如何去除內(nèi)源或同源蛋白。不確定的成分，像動(dòng)物肽類物質(zhì)的引入，勢(shì)必會(huì)增加提取、分離、純化的步驟，一方面使成本提高，另一方面也會(huì)影響生物制品的產(chǎn)量和質(zhì)量。
2.2平衡鹽溶液
平衡鹽溶液（balanced salt solution，BSS ）簡(jiǎn)稱鹽溶液，集緩沖液的緩沖能力、生理鹽水的等滲性以及培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)特點(diǎn)于一體，兼具維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)溶液的酸堿度、同時(shí)供給細(xì)胞生存所必需的能量和無(wú)機(jī)離子成分的作用。各種BSS的緩沖系統(tǒng)有所不同，其中以Hank’s液和Earle’s液為例，它們主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Earle’s (2.2 g/L)中比在Hank’s (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的pH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會(huì)變堿，Hank’s液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Earle’s液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hank’s液就可以了。
 表 3-1 幾種常用的平衡鹽溶液配方（g/L）
一些BSS含有的Ca2+、Mg2+是細(xì)胞膜的重要組成成分，同時(shí)參與許多重要的細(xì)胞功能活動(dòng)。但它們有使細(xì)胞凝集的作用，在配制分散細(xì)胞的消化液和特殊用途的細(xì)胞洗滌時(shí)，宜采用Ca2+、Mg2+含量較低的Dulbecco液或無(wú)Ca2+、Mg2+的D-Hanks液，或者PBS液。
2.3基礎(chǔ)培養(yǎng)基
2.3.1 概述
基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基主要包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM 、DMEM/F12等。主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加一定量的血清使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖。
2.3.2 組成及作用
氨基酸：組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同的細(xì)胞對(duì)氨基酸的需求各異，但幾種必需氨基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，如組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等。其余非必需氨基酸，細(xì)胞可以自己合成，或通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用由其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來(lái)。絕大部分細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺有較高的要求，因?yàn)楣劝滨０肥亲鳛槟茉?/div>
及碳源物質(zhì)同時(shí)被細(xì)胞利用，是是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡，所以各種培養(yǎng)液中都含有較多的谷氨酰胺。細(xì)胞所能利用的氨基酸是L型同分異構(gòu)體，D型氨基酸不能被利用。
維生素：維持細(xì)胞生長(zhǎng)的一種生物活性物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞代謝有重大作用。它們?cè)诩?xì)胞中大多形成酶的輔基或輔酶，沒(méi)有它們，酶便沒(méi)有活性，代謝活動(dòng)將無(wú)法進(jìn)行。維生素分為水溶和脂溶兩大類，的培養(yǎng)液中直接采用ATP和輔酶A。
葡萄糖：大部分培養(yǎng)基都以葡萄糖作為能量來(lái)源之一。
無(wú)機(jī)鹽：維持培養(yǎng)基滲透壓平衡，參與細(xì)胞的代謝活動(dòng)。主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+等。Na+是細(xì)胞外液中最主要的陽(yáng)離子，對(duì)維持滲透壓的恒定有決定性的作用。K+主要分布在細(xì)胞內(nèi)液，細(xì)胞內(nèi)K+對(duì)于激活某些酶是必需的，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡上也有極重要意義。Ca2+在細(xì)胞外液中的作用是將組織內(nèi)部細(xì)胞之間相互粘著，在細(xì)胞內(nèi)參與許多重要的細(xì)胞生理活動(dòng)，如傳導(dǎo)、參與肌肉細(xì)胞收縮等。在懸浮培養(yǎng)時(shí)，為了減少細(xì)胞的聚集和附著，要減少Ca2+的濃度。Mg2+是構(gòu)成細(xì)胞間質(zhì)的重要成分，對(duì)于細(xì)胞間相互穩(wěn)定結(jié)合有很重要的意義。磷的化合物對(duì)細(xì)胞物質(zhì)代謝和生理功能調(diào)控有重要作用。
其他成分：肽、核苷、嘌呤等。可幫助細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細(xì)胞系的生長(zhǎng)。
2.3.3 分類
 2.4 低血清細(xì)胞培養(yǎng)基
2.4.1 概述
營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基是維持細(xì)胞活性及高密度生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，營(yíng)養(yǎng)缺乏容易引起細(xì)胞凋亡，新生牛血清中所含大部分營(yíng)養(yǎng)成分可以通過(guò)化學(xué)成分明確的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸維生素等成分組合取代。低血清培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分大優(yōu)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，僅需添加1％～5％新生牛血清，而對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、形態(tài)、活性和功能沒(méi)有影響甚至有所改善。
在國(guó)外低血清培養(yǎng)基早已有之，如Gibco等。但是他們的低血清培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中選擇性的加入重組胰島素（recombinant insulin）、人源轉(zhuǎn)鐵蛋白（human (holo) tran- sferrin）以及牛血清白蛋白等，有些還包含一些生長(zhǎng)因子，這些重組蛋白和動(dòng)物來(lái)源成分對(duì)生物制品的安全性有很大影響。成本低。
2.4.2 主要用途
 2.4.3 應(yīng)用案例
采用199(SLM)、MEM(SLM)和DMEM（SLM）低血清培養(yǎng)基分別培養(yǎng)Vero細(xì)胞、BHK21細(xì)胞和CHO細(xì)胞，新生牛血清用量可以從10％降至3％，減少新生牛血清使用批次和批間差的影響，減少生物制品純化損失，減少由于不確定蛋白或者其它血清組分帶來(lái)干擾和差異的風(fēng)險(xiǎn)，提高制品安全性。低血清培養(yǎng)基可以在方瓶、3L轉(zhuǎn)瓶、15L 轉(zhuǎn)瓶及生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞，在疫苗生產(chǎn)中可以達(dá)到低血清高密度的培養(yǎng)效果。低血清培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分優(yōu)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，易使細(xì)胞增殖迅速，代謝旺盛，代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有不良影響，易產(chǎn)生細(xì)胞老化脫落現(xiàn)象。因此需要適當(dāng)增加換液次數(shù)，增加傳代頻率。獲取同樣的細(xì)胞量，用低血清培養(yǎng)基將比用傳統(tǒng)培養(yǎng)基縮短近1/3 的時(shí)間，可提高生產(chǎn)效率。
采用199(SLM)低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞分泌狂犬疫苗病毒，滴度明顯高于采用199 培養(yǎng)基傳統(tǒng)培養(yǎng)獲得的滴度。采MEM(SLM)低血清培養(yǎng)基BHK21細(xì)胞，在本實(shí)驗(yàn)情況下12 代內(nèi)細(xì)胞形態(tài)和致密度均優(yōu)于MEM培養(yǎng)基傳統(tǒng)培養(yǎng)情況，因而可以預(yù)期其產(chǎn)生的口蹄疫、甲肝等疫苗生產(chǎn)的病毒產(chǎn)量將提高。低血清培養(yǎng)基用于反應(yīng)器Vero細(xì)胞狂犬疫苗的生產(chǎn)，實(shí)踐證明效果良好。采DMEM（SLM）低血清培養(yǎng)基添加1％小牛血清在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)CHO細(xì)胞生產(chǎn)EOP，可提高收液次數(shù)，每次收液表達(dá)量明顯提高。
2.5無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基
2.5.1 概述
無(wú)血清培養(yǎng)基是用來(lái)在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)特殊類型的細(xì)胞或進(jìn)行專門(mén)應(yīng)用的培養(yǎng)基。一般是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充因子組成。無(wú)血清培養(yǎng)基中沒(méi)有添加血清，但含有個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。無(wú)血清培養(yǎng)基與無(wú)蛋白培養(yǎng)基的區(qū)別在于培養(yǎng)基中沒(méi)有添加蛋白，但含有一些動(dòng)物或植物來(lái)源成分，如低分子量肽的水解物。還有一種化學(xué)限定培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中不含有蛋白、水解產(chǎn)物或未知結(jié)構(gòu)的組分，所有成分均有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
優(yōu)點(diǎn)：
1） 未知組分少；
2） 培養(yǎng)基中不存在血清中的抗體、補(bǔ)體等成分，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞影響??；
3） 雜蛋白含量少，生產(chǎn)的產(chǎn)品后期處理較容易，例如疫苗生產(chǎn)由于人用疫苗需要純化減少雜蛋白，純化過(guò)程中成本消耗很大，疫苗的損失也很大；
4） 無(wú)血清培養(yǎng)既可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，增加培養(yǎng)液的利用率，可以采用發(fā)酵罐培養(yǎng)減少了人力消耗。
缺點(diǎn)：
目前為止不是所有的細(xì)胞都能在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。無(wú)血清培養(yǎng)基的某些組分價(jià)格昂貴，導(dǎo)致無(wú)血清無(wú)法工業(yè)推廣的主要原因。
2.5.2 無(wú)動(dòng)物組分無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基的應(yīng)用
 三、細(xì)胞培養(yǎng)基的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法 3.1細(xì)胞培養(yǎng)基的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)  3.2細(xì)胞培養(yǎng)基的檢測(cè)方法
3.2.1 澄清度
水是細(xì)胞培養(yǎng)基的溶劑。細(xì)胞培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分只有完全溶解于水才能被細(xì)胞吸收攝取，細(xì)胞才能生長(zhǎng)增殖，因此細(xì)胞培養(yǎng)基是否溶解以及培養(yǎng)液是否透明澄清直接影響培養(yǎng)基使用。該項(xiàng)目是通過(guò)對(duì)水溶解后的細(xì)胞培養(yǎng)基的澄清度檢查，判斷細(xì)胞培養(yǎng)基的澄清度。 按中華人民共和國(guó)藥典2005年版二部附錄Ⅸ B進(jìn)行。
3.2.2 pH 值
哺乳類動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)需要合適的酸堿度，pH過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。pH值的測(cè)定也可以檢查細(xì)胞培養(yǎng)基的批間差。清大天一標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定取規(guī)定量供試品，用注射用水（水溫20℃-30℃）溶解至1L，加入規(guī)定量碳酸氫鈉到上述溶液中，用與細(xì)胞培養(yǎng)基溶液pH值相近的兩點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校準(zhǔn)后的酸度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。按中華人民共和國(guó)藥典2005年版二部附錄Ⅵ H進(jìn)行；加入規(guī)定量的碳酸氫鈉（見(jiàn)表4-12）到上述溶液中，按中華人民共和國(guó)藥典2005年版二部附錄Ⅵ H進(jìn)行。
3.2.3 干燥減量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)
細(xì)胞培養(yǎng)基具有吸濕性，在空氣中放置水分會(huì)很快升高，干燥減量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示產(chǎn)品中含濕量。細(xì)胞培養(yǎng)基是有菌制劑，其豐富的營(yíng)養(yǎng)成分有利于微生物生長(zhǎng)，控制細(xì)胞培養(yǎng)基中的水分可以防止微生物的繁殖，保持細(xì)胞培養(yǎng)基的養(yǎng)分。按中華人民共和國(guó)藥典2005 年版二部附錄Ⅷ L 干燥失重測(cè)定法進(jìn)行。
3.2.4 滲透壓
溶劑通過(guò)半透膜由低濃度向高濃度溶液擴(kuò)散的現(xiàn)象稱為滲透，阻止?jié)B透所需施加的壓力，稱為滲透壓。細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，動(dòng)物細(xì)胞借助K＋、Na＋維持滲透平衡。大多數(shù)細(xì)胞對(duì)滲透壓有一定的耐受性。但是培養(yǎng)液滲透壓過(guò)高容易使細(xì)胞脫水萎縮，培養(yǎng)液滲透壓過(guò)低容易使細(xì)胞膨脹破裂，因此要控制培養(yǎng)基的滲透壓范圍。按中華人民共和國(guó)藥典2005 年版二部附錄Ⅸ G 滲透壓摩爾濃度測(cè)定法進(jìn)行。
3.2.5 細(xì)菌內(nèi)毒素
細(xì)菌內(nèi)毒素是許多病原性細(xì)菌所產(chǎn)生的毒素。它的特殊性在于不是細(xì)菌或細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，而是細(xì)菌死亡或解體后才釋放出來(lái)的一種具有生物活性的物質(zhì)。培養(yǎng)基細(xì)菌內(nèi)毒素過(guò)高，對(duì)生物制品疫苗（如狂犬、乙肝疫苗）、基因工程藥品等注射用的藥品都需要檢查細(xì)菌內(nèi)毒素。 因此本項(xiàng)目的檢驗(yàn)符合生物制品質(zhì)量控制要求。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)定為＜10 EU/ml。稱取本品規(guī)定量（見(jiàn)表4-12）的1/100，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水10 mL溶解，吸取該溶液0.1 mL加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水3.9 mL，混勻即得試樣。按中華人民共和國(guó)藥典2005 年版二部附錄Ⅺ E 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法進(jìn)行。
3.2.6 微生物限度
細(xì)胞培養(yǎng)基不是無(wú)菌產(chǎn)品，其中的微生物在一定條件下會(huì)吸收細(xì)胞培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滋生繁殖，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基變質(zhì)失效?？刂萍?xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)菌和霉菌，是延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基有效期的方法之一。清大天一在參考《中華人民共和國(guó)藥典》2005版二部附錄第100頁(yè)的口服給藥制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，并嚴(yán)于該標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品的細(xì)菌數(shù)每1g不得超過(guò)200個(gè)，霉菌數(shù)每1g不得超過(guò)
50個(gè)。
稱取樣品1 g，加入無(wú)菌純化水10 mL溶解，混勻即得試樣。按中華人民共和國(guó)藥典2005年版二部附錄Ⅺ J 微生物限度檢查法進(jìn)行，檢查項(xiàng)目為細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)。檢查法采用平皿法。
3.2.7 細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)
這是一個(gè)性能特性表述的要求。細(xì)胞培養(yǎng)基的功能就是培養(yǎng)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞，因此經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)效果的檢驗(yàn)是產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣的直觀表述，這也是很多生物制藥用戶要求的一項(xiàng)指標(biāo)。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)和計(jì)數(shù)的法定方法，可參考《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》中細(xì)胞計(jì)數(shù)法論述的內(nèi)容給出。按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)配制培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，前四天用含10％小牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形
態(tài)并計(jì)數(shù)，檢查細(xì)胞培養(yǎng)基是否有促生長(zhǎng)的能力。后三天用不含小牛血清的培養(yǎng)液維持培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)，檢查細(xì)胞培養(yǎng)基中是否有不利細(xì)胞生長(zhǎng)的毒素。本試驗(yàn)用細(xì)胞為VERO細(xì)胞。
四、細(xì)胞培養(yǎng)基的使用方法 細(xì)胞培養(yǎng)基的種類繁多，細(xì)胞培養(yǎng)方式也較多，如何正確地使用培養(yǎng)基及最大程度地保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)每個(gè)培養(yǎng)者都很重要。培養(yǎng)基的使用依不同的培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)方式、細(xì)胞種類的不同而存在差異。
4.1 細(xì)胞培養(yǎng)液的構(gòu)成
細(xì)胞培養(yǎng)液指細(xì)胞生長(zhǎng)的液體環(huán)境，一般指完全培養(yǎng)液，添加了血清、水解乳蛋白、各種添加劑等可以直接使用的培養(yǎng)液。
4.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)基&血清模式
血清對(duì)于在傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方中生長(zhǎng)和增殖的大多數(shù)細(xì)胞系來(lái)說(shuō)是需要的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)單獨(dú)的培養(yǎng)基并不能提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的全部營(yíng)養(yǎng)，如MEM培養(yǎng)基，較為常用的量為5％～10％的比例，而特殊的低血清培養(yǎng)基血清量可降至3％左右，細(xì)胞的形態(tài)和功能不受影響。
4.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)基&乳歐液模式
化學(xué)合成培養(yǎng)基現(xiàn)雖已大規(guī)模使用，但在某些培養(yǎng)領(lǐng)域水解乳蛋白仍在使用，以補(bǔ)充培養(yǎng)液中缺乏的氨基酸、小肽物質(zhì)。較為常用的方式是用漢氏（Hanks’ BSS）或歐式(Earle’s BSS)平衡液溶解水解乳蛋白（一般為5‰濃度），即成乳漢（歐）液，再與化學(xué)合成培養(yǎng)基（一般為MEM）按比例混合使用（如1：1）。
4.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)基&各類添加劑（生長(zhǎng)因子等）模式
成分復(fù)雜的培養(yǎng)基還含有許多化合物，包括蛋白質(zhì)、多肽、核苷、檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物、丙酮酸及脂類等。已發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中的血清濃度減少時(shí)，這些成分都是必需的。既使在使用血清的情況下，這些成分也可幫助細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細(xì)胞系的生長(zhǎng)。激素和生長(zhǎng)因子在大多數(shù)常規(guī)培養(yǎng)基的配方中都沒(méi)有注明，但在無(wú)血清培養(yǎng)基中通常要加入它們，用其來(lái)代替血清中的激素能增加多種不同類型細(xì)胞的貼瓶率；生長(zhǎng)因子包括FGF家族、EGF、PDGF、IGF－1和IGF－2及白介素等，生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子有著廣泛的特異性，一般與激素或其它物質(zhì)起相互協(xié)同或加成作用。另一種常見(jiàn)的添加物就是血清替代物，目前已有許多可完全或部分替代傳統(tǒng)培養(yǎng)液中血清成分的商業(yè)產(chǎn)品，其穩(wěn)定性較好，但批次間仍有差別，產(chǎn)品的成分也不很確定。
4.2細(xì)胞培養(yǎng)基配制
4.2.1 干粉培養(yǎng)基原倍液的配制
1）配制過(guò)濾除菌的細(xì)胞培養(yǎng)基
(1) 閱讀培養(yǎng)基使用說(shuō)明，確定需要添加何種添加劑（如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等）。
(2) 根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解。
(3) 加入規(guī)定量的碳酸氫鈉及所要添加的物質(zhì)。
(4) 輕微攪拌溶解，加注射用水至規(guī)定體積。
(5) 用1 mol / L 氫氧化鈉溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。
(6) 用0.22 μm濾膜正壓過(guò)濾除菌。
(7) 溶液應(yīng)在2℃－8℃下避光保存。
具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說(shuō)明書(shū)。
2）配制可高壓滅菌細(xì)胞培養(yǎng)基
(1) 根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解。
(2) 在121℃、15psi下滅菌15分鐘。
(3) 待溶液冷卻至室溫，加入無(wú)菌0.2 mol / L L－谷氨酰胺溶液規(guī)定體積、無(wú)菌7.5％（w/v）碳酸氫鈉溶液規(guī)定體積，加注射用水（20℃～30℃）至規(guī)定體積，混勻。
(4) 如果必要，用1 mol / L 氫氧化鈉溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。
(5) 溶液應(yīng)在2℃－8℃下避光保存。
具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說(shuō)明書(shū)。
4.2.2 注意事項(xiàng)
1） 細(xì)胞培養(yǎng)用水一般為三蒸水（經(jīng)石英蒸餾器蒸餾）或超純水，醫(yī)藥生產(chǎn)上一般為注射用水。
2） 建議盡量選擇與所用量相匹配的包裝一次使用，因?yàn)榘b一旦打開(kāi)，組分可能會(huì)變質(zhì)或因受潮而結(jié)團(tuán)。
3） 溶解干粉培養(yǎng)基時(shí)先加入終體積90％－95％的培養(yǎng)用水，添加劑加完后再補(bǔ)足。
4） 如需添加的組分較多時(shí)，某一組分完全溶解后，再添加另一組分。
5） 待培養(yǎng)基完全溶解后再加入碳酸氫鈉，以免產(chǎn)生沉淀。
6） 所有成分完全溶解后，培養(yǎng)基應(yīng)立即過(guò)濾或高壓除菌，以免產(chǎn)生沉淀或有微生物污染。
7） 在過(guò)濾除菌時(shí)，一般情況下應(yīng)調(diào)pH比所需值低0.1～0.2個(gè)單位，因過(guò)濾除菌后，pH值會(huì)升高約0.2。
8） 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，建議不加或加少量的抗生素，如血清的濃度較低則所加抗生素的量也要相應(yīng)降低一些。
9） 建議用1 N HCl或1 N NaOH來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，因?yàn)橛锰妓釟溻c來(lái)調(diào)對(duì)培養(yǎng)液的滲透壓影響比較大。如下圖所示：
 圖6-1 MEM培養(yǎng)基（SLM，MD611）在pH值相同情況下所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液滲透壓
 圖6-2 199培養(yǎng)基（MD502）在pH值相同情況下所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液滲透壓
4.3 培養(yǎng)基滅菌 培養(yǎng)基的滅菌方法主要有兩種，高壓除菌及0.22 um微孔濾膜過(guò)濾除菌。與過(guò)濾相比，高壓滅菌的工作強(qiáng)度小，相對(duì)便宜，失敗率低，但易造成營(yíng)養(yǎng)成分的流失。 4.3.1 高壓滅菌
某些培養(yǎng)基（如MEM）可進(jìn)行高壓滅菌，例如清大天一的MEM培養(yǎng)基中的MD605、MD609等。其中不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，可在高壓滅菌后加入。另外可高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）可代替L-谷氨酰胺。
為保證高壓滅菌的效果，滅菌設(shè)備的驗(yàn)證很關(guān)鍵，可高壓滅菌的培養(yǎng)基在121℃、15psi，15分鐘的條件下完全可達(dá)到滅菌效果及營(yíng)養(yǎng)成分的最小損失，因此不需將滅菌時(shí)間延長(zhǎng)。
4.3.2 過(guò)濾滅菌
大多數(shù)培養(yǎng)基采用0.1～0.2 μm孔徑的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾滅菌，并且已成為培養(yǎng)基除菌的發(fā)展方向，它可低限度地減少培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)損失。
4.4 細(xì)胞培養(yǎng)液的儲(chǔ)存
細(xì)胞培養(yǎng)液的儲(chǔ)存條件一般為2－8℃、密閉、避光保存，但要注意如下幾點(diǎn)：
1） 過(guò)濾后的完全培養(yǎng)液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培養(yǎng)液要盡快使用，一般在2－3周內(nèi)使用完。培養(yǎng)液中的L-谷氨酰胺是不穩(wěn)定的，不同溫度L－谷氨酰胺的降解見(jiàn)下圖
 圖 6-3 pH 為7.6時(shí)不同溫度2mM谷氨酰胺的穩(wěn)定性
 圖 6-4 室溫下不同pH時(shí)10mM谷氨酰胺的穩(wěn)定性
2） 滅菌后的未加L-谷氨酰胺等添加劑的培養(yǎng)基溶液，一般可在4℃保存6～9個(gè)月，也可冷凍保存，用時(shí)解凍。
3） 高壓除菌后的培養(yǎng)基應(yīng)置4℃保存，不能因?yàn)槠淇赡褪芨邷囟雎詢?chǔ)存溫度。
4） 添加某些生長(zhǎng)因子、激素等添加物，可能會(huì)改變培養(yǎng)液的儲(chǔ)存條件，比如溫度、時(shí)間等方面的要求。
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