lonza 無血清 培養(yǎng)基      

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1、如何選用培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無血清培養(yǎng)的首選是AIM V培養(yǎng)基（SFM）。

2、為什么要熱滅活血清？

加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。

3、L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L－谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L－谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。

4、GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？

GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，將其不穩(wěn)定的α－氨基用L－丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L－谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L－谷氨酰胺幾乎完全降解。

5、為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

6、如何用臺盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？

用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200－2000個(gè)/毫升，在0.1毫升的細(xì)胞中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。

7、如何消除組織培養(yǎng)的污染？

當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。

1)在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。

2)分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3)每天觀測細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

4)確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2－3代。

5)在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。

6)重復(fù)步驟4。

7)在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4－6代，確定污染是否以已被消除。

8、培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源。盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

9、Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO₂培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）和Earle’s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別？

HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO₂平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO₂ 中，溶液會變堿，Hanks液在CO₂培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO₂培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

10、Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?

Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)程序，而且除了這些標(biāo)準(zhǔn)檢測，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測：
End-Point Determination of Endotoxin Content、噬菌體檢驗(yàn)、生物化學(xué)檢測、激素的檢測、血紅蛋白檢測、Sf9 細(xì)胞生長促進(jìn)及方法學(xué)檢測。

11、二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？

二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。

12、制備 lipid-DNA的方法會影響轉(zhuǎn)染效率嗎？

是的。對于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中，稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中。混合兩種溶液在室溫下孵育15分鐘。對于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養(yǎng)基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復(fù)合物在沒有血清的情況下形成。孵育15分鐘后，在復(fù)合物中加入含有血清的培養(yǎng)基（800μl）。（注意以上是35mm培養(yǎng)皿使用體積）。對于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應(yīng)該在與脂質(zhì)體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個(gè)很小的體積下混合DNA和脂質(zhì)體，接下來可以不需要換培養(yǎng)基的情況下直接加入。

13、我使用SF900 Ⅱ時(shí)，細(xì)胞生長良好，但是為什么我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時(shí)效果好？

如果目的蛋白是一個(gè)后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達(dá)，這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。

14、如何檢測內(nèi)毒素(熱源)水平？

LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗(yàn)是可用的最敏感和特異的檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。Levin和Bang 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內(nèi)的凝集作用。內(nèi)毒素啟動一個(gè)細(xì)胞內(nèi)酶原系統(tǒng)（絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)），通過修飾凝集素，產(chǎn)生一種透明的膠，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質(zhì)。LAL試劑緩沖的鱟（血細(xì)胞）裂解物。

胎牛血清的內(nèi)毒素檢測是在Grand Island，按照手冊上Gel-clot 方法進(jìn)行的。在對血清產(chǎn)品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測前，用無熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內(nèi)毒素結(jié)合成份的出現(xiàn)會抑制凝膠過程，使內(nèi)毒素不能與LAL反應(yīng)。樣品預(yù)先熱處理可以消除這種抑制作用。）

15、我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養(yǎng)基嗎？

如果使用固體形式的培養(yǎng)基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應(yīng)該避免MS培養(yǎng)基的直接滅菌，應(yīng)該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養(yǎng)基中。

16、20℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎？

對于普通使用的緩沖液，PH值隨溫度變化而變化。下表列出溫度改變10℃時(shí)，PH值的變化情況：如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時(shí)PH值為 7.4-（2x0.310）＝6.78。

17.、室溫下(25℃)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時(shí)PH值是多少？

緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時(shí)，不同的PH值。

18、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的最適PH值和滲透壓是多少？

生長培養(yǎng)基的PH值對細(xì)胞的增值和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會產(chǎn)生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細(xì)胞系，在PH值 6.0－6.4范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲細(xì)胞系時(shí)，培養(yǎng)基的最適滲透壓是 345－380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細(xì)胞培養(yǎng)方式，減少技術(shù)問題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。

19、High Five細(xì)胞有任何其它名稱嗎？

High Five細(xì)胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

20、在High Five無血清養(yǎng)基中去污劑的濃度是多少？

High Five無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

21、High Five細(xì)胞用多大的密度凍存？

3.0x10⁶ cells/ml 。

22、在我的果蠅培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對我的細(xì)胞有害嗎？

可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復(fù)合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養(yǎng)條件下可以溶解，對實(shí)驗(yàn)不會有不利的影響。

23、如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細(xì)胞？能用胰蛋白酶消化嗎？

我們強(qiáng)力推薦使用脫落細(xì)胞的方法，因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)破壞性最小，生活力最高。通過使用巴氏德吸液管，讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在絕對必要的情況下，才使用胰酶消化細(xì)胞。

胰酶消化一個(gè)T25瓶的sf9細(xì)胞：

1)去除培養(yǎng)基。

2) 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細(xì)胞表面）洗滌細(xì)胞，去除PBS。

3) 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細(xì)胞表面）。

4) 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。

5) 向細(xì)胞中加入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。）

6) 離心（1100rpm）沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。

7) 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。

24、在Sf9, Sf21, 和high Five細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，肝素的使用量是多少？

為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細(xì)胞懸液。

25、如何評估ES細(xì)胞合格的胎牛血清？

使用D3 ES細(xì)胞。這是一個(gè)對于胎牛血清中生長促進(jìn)、生長抑制和分化因子非常敏感的細(xì)胞系。
相關(guān)生長效率分析：

當(dāng)ES細(xì)胞以非常低的密度傳入包含10％胎牛血清的生長培養(yǎng)基中，檢測開始和支持ES細(xì)胞克隆的能力。

細(xì)胞毒分析：

當(dāng)以非常低的密度傳入包含30％胎牛血清的生長培養(yǎng)基中，檢測ES細(xì)胞和feeder細(xì)胞的生長能力。

相關(guān)形態(tài)學(xué)和分化分析：

檢測胎牛血清支持未分化ES細(xì)胞克隆的能力。通過堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的ES細(xì)胞小顏色深紅粉紅，分化的細(xì)胞較大，豐滿，顏色較淺。

所有的分析在沒有ESGRO的情況下進(jìn)行的，培養(yǎng)基中出現(xiàn)ESGRO會掩蓋由胎牛血清所導(dǎo)致的問題。（ESGRO或LIF經(jīng)常用來保持ES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。）經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，大約8批中有1批可以用來培養(yǎng)ES細(xì)胞。

26、在重新凍存sf9細(xì)胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會降低嗎？

通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過30次傳代后，應(yīng)該返回凍存。無論什么時(shí)候記數(shù)時(shí)，都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過95％的細(xì)胞保持有活力和在大約30小時(shí)左右加倍，細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降，它們的感染力將不在是有效的。

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