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1.如何選用培養基？

培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，首選MEM做粘附細胞培養、RPMI- 1640做懸浮細胞培養，各種目的無血清培養的首選是AIM V培養基（SFM）

2.為什么要熱滅活血清？

加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。

3.L－谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？

L－谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L－谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L－谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？

GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，將其不穩定的α－氨基用L－丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L－谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L－谷氨酰胺幾乎完全降解。

5.為什么培養基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。

6.如何用臺盼蘭計數活細胞？

用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200－2000個/毫升，在0.1毫升的細胞中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數分鐘后，用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。

7.如何消除組織培養的污染？

重要的培養污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。

下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟:

1 在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。

2 分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3 每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。

4 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2－3代。

5 在無抗生素的培養基中培養細胞一代。

6 重復步驟4。

7 在無抗生素的培養基中培養4－6代，確定污染是否以已被消除。

8.培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源。盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

9.為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉淀？

GIBICO的胎牛血清 沒有預老化，儲存在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。推薦在－20℃儲存胎牛血清，避免反復凍融。

10.目錄上說，Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）和Earle’s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質的功能差別？

HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在 CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

11.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?

Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執行的所有的標準檢驗程序，而且除了這些標準檢測，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測：

End-Point Determination of Endotoxin Content

噬菌體檢驗

生物化學檢測

激素的檢測

血紅蛋白檢測

Sf9 細胞生長促進及方法學檢測

12.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。

13.制備 lipid-DNA的方法會影響轉染效率嗎？

是的。對于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中，稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中。混合兩種溶液在室溫下孵育15分鐘。對于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復合物在沒有血清的情況下形成。孵育15分鐘后，在復合物中加入含有血清的培養基（800μl）。（注意以上是35mm培養皿使用體積）。對于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應該在與脂質體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個很小的體積下混合DNA和脂質體，接下來可以不需要換培養基的情況下直接加入。對于每一種脂質體的詳細的信息可以參考產品說明書。

14.我使用SF900 Ⅱ時，細胞生長良好，但是為什么我的蛋白產物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好？

如果目的蛋白是一個后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達，這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。

15.如何檢測內毒素(熱源)水平？

LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗是可用的最敏感和特異的檢測細菌內毒素的方法。Levin和Bang 發現細菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內的凝集作用。內毒素啟動一個細胞內酶原系統（絲氨酸蛋白酶級聯反應系統），通過修飾凝集素，產生一種透明的膠，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質。LAL試劑緩沖的鱟（血細胞）裂解物。

胎牛血清的內毒素檢測是在Grand Island，按照手冊上Gel-clot 方法進行的。在對血清產品進行內毒素檢測前，用無熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內毒素結合成份的出現會抑制凝膠過程，使內毒素不能與LAL反應。樣品預先熱處理可以消除這種抑制作用。）

16.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養基嗎？

如果使用固體形式的培養基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應該避免MS培養基的直接滅菌，應該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養基中。

17.20℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎？

對于普通使用的緩沖液，PH值隨溫度變化而變化。

下表列出溫度改變10℃時，PH值的變化情況

例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時PH值為 7.4-（2x0.310）＝6.78

緩沖系統 pKa/20℃ [Delta]pKa/10℃

Mes 6.15 -0.110

Ada 6.60 -0.110

Pipes 6.80 -0.085

Aces 6.90 -0.200

Bes 7.15 -0.160

Mops 7.20 -0.013

Tes 7.50 -0.200

Hepes 7.55 -0.140

Tricine 8.15 -0.210

Tris 8.30 -0.310

Bicine 8.35 -0.180

Glycylglycine 8.40 -0.280

18.室溫下(25℃)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時PH值是多少？

緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同的PH值。

4℃ 25℃ 37℃

8.1 7.5 7.2

8.2 7.6 7.3

8.3 7.7 7.4

8.4 7.8 7.5

8.5 7.9 7.6

8.6 8.0 7.7

8.7 8.1 7.8

8.8 8.2 7.9

8.9 8.3 8.0

9.0 8.4 8.1

9.1 8.5 8.2

9.2 8.6 8.3

9.3 8.7 8.4

9.4 8.8 8.5

19.昆蟲細胞培養的最適PH值和滲透壓是多少？

生長培養基的PH值對細胞的增值和病毒或重組蛋白的生產均會產生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系，在PH值 6.0－6.4范圍的大部分應用效果良好。培養鱗翅類昆蟲細胞系時，培養基的最適滲透壓是 345－380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細胞培養方式，減少技術問題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內。

20.High Five細胞有任何其它名稱嗎？

High Five細胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

21.PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之間有什么差別？

PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白質的單克隆抗體生產培養基。如果作為雜交瘤生產培養基使用，PFHM-II可能需要補充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM即是雜交瘤生產培養基，也是單克隆抗體生產培養基。它包含低水平的蛋白質。

22.在High Five無血清培養基中去污劑的濃度是多少？

High Five無血清培養基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

23.High Five細胞用多大的密度凍存？

3.0x10E6 cells/ml

24.在我的果蠅培養基中發現形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對我的細胞有害嗎？

可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養條件下可以溶解，對實驗不會有不利的影響。

25.如何從T25瓶中轉移sf9細胞？能用胰蛋白酶消化嗎？

我們強力推薦使用脫落細胞的方法，因為這項技術破壞性最小，生活力最高。正如手冊上所顯示，通過使用巴氏德吸液管，讓細胞上培養基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在絕對必要的情況下，才使用胰酶消化細胞。

胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞：

1. 去除培養基。

2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除PBS.

3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細胞表面）。

4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。

5. 向細胞中加入2ml 細胞培養液，移入錐形管，用2ml培養液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養基中的FBS終止了胰酶的活性。）

6. 離心（1100rpm）沉淀細胞。去除培養基。

7. 用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。

26.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時，肝素的使用量是多少？

為了防止懸浮培養細胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。

27.如何評估ES細胞合格的胎牛血清？

使用D3 ES細胞。這是一個對于胎牛血清中生長促進、生長抑制和分化因子非常敏感的細胞系。

相關生長效率分析：

當ES細胞以非常低的密度傳入包含10％胎牛血清的生長培養基中，檢測開始和支持ES細胞克隆的能力。

細胞毒分析：

當以非常低的密度傳入包含30％胎牛血清的生長培養基中，檢測ES細胞和feeder細胞的生長能力。

相關形態學和分化分析：

檢測胎牛血清支持未分化ES細胞克隆的能力。通過堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的ES細胞小顏色深紅粉紅，分化的細胞較大，豐滿，顏色較淺。

所有的分析在沒有ESGRO的情況下進行的，培養基中出現ESGRO會掩蓋由胎牛血清所導致的問題。（ESGRO或LIF經常用來保持ES細胞處于未分化狀態。）

經過培養發現，大約8批中有1批可以用來培養ES細胞。

28.在重新凍存sf9細胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數的增加，它的感染能力會降低嗎？

通常情況當細胞經過30次傳代后，應該返回凍存。無論什么時候記數時，都應該檢查細胞活力。如果超過95％的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。

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