Clonetics原代細(xì)胞及培養(yǎng)基系統(tǒng)

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一、原理

將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖，這一過(guò)程稱原代培養(yǎng)。

二、儀器、材料及試劑

儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至37℃），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計(jì)數(shù)板、離心機(jī)、水浴箱（37℃）

材料：胎鼠或新生鼠

試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank's液，碘酒

三、操作步驟

（一）胰酶消化法

1、器材：將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺(tái)內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_(tái)內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。

2、用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。

3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1mm），再用Hank's液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。

4、視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。

5、加入3-5ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。

6、靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。

7、1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。

8、加入Hank's液5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。

9、加入培養(yǎng)液l-2 ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

10、將細(xì)胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。

上述消化分離的方法是最基本的方法，在該方法的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步分離不同細(xì)胞。細(xì)胞分離的方法各實(shí)驗(yàn)室不同，所采用的消化酶也不相同（如膠原酶，透明質(zhì)酶等）。

（二）組織塊直接培養(yǎng)法

自上方法第3步后，將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附與瓶底面。翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。入37℃靜置3―5小時(shí)，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)。

四、注意事項(xiàng)

1、自取材開(kāi)始，保持所有組織細(xì)胞處于無(wú)菌條件。細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。

2、在超凈臺(tái)中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過(guò)久，以免溶液蒸發(fā)。

3、凡在超凈臺(tái)外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細(xì)菌落入。

五、無(wú)菌操作的幾個(gè)注意事項(xiàng)

1、操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。

2、點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過(guò)營(yíng)養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。

3、操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。

4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺(tái)面上用品要布局合理。

5、瓶子開(kāi)口后要盡量保持45^。斜位。

6、吸溶液的吸管等不能混用。

附：Hank's液配方：

KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4•H2O 0.06g，加H2O至1000ml。

注：Hank's液可以高壓滅菌，4℃下保存。

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