| ? | ||||||||||||
|
||||||||||||
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
| 購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 www.adsraven.com |
lonza 無血清 培養基 火熱促銷之中......點擊如下網址： http://bitebo.com/a/gb2312/gongsixinxi/shichanghuodong/2013/0331/5024.html
細胞培養基
市場上可提供干粉培養基和液體培養基：
干粉培養基需使用者自己配制并滅菌，其優點是價格便宜。缺點是配制過程繁瑣，質量不易控制；
液體培養基是由專業廠家按標準規?；a，不僅質量得到保證，而且使用十分方便
常用的培養基種類：
RPMI-1640（標準型）、DMEM-高糖（標準型）、DMEM-低糖（標準型）、McCoys 5A、 M199、F10等
1000 ml RPMI1640培養基
RPMI1640干粉培養基10.4g（1包）
蒸餾水400ml
↓
磁力攪拌至完全溶解
↓
加三蒸餾水定容至1000ml
在超凈臺內無菌條件下，用滅菌后的并置有0.22μm孔徑濾膜的過濾器除菌，并分裝成200 ml/瓶，-20℃保存備用。
用前取一瓶溶解，每200 ml培養液加滅活的小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。再加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100 U/ml。
↓
細胞培養液
血清
熱滅活：56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清
熱滅活目的：滅活血清中的補體成分。如果不做細胞因子和免疫相關的實驗，建議血清不要滅活。因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多，還會影響血清的質量。滅活后嚴重影響細胞生長速度，且細胞貼壁率降低。
血清中的沉淀物：
— 絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質量?？捎秒x心3000 rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理
— 顯微鏡下“小黑點”：經過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長，但如果懷疑血清質量，則應立即停止使用，更換另一批號的血清
平衡鹽液體
組織細胞培養中常用的基本液體，可以維持滲透壓、調節pH值、供給細胞生存所需的能量和無機離子成分，用于洗滌組織、細胞等
（Phohate-Buffered Sallines）：
KCl 0.20g KH2PO4 0.20g
NaCl 8.00g Na2HPO4•7H2O 2.16g
D（Dulbecco’s Phohate-Buffered Sallines）標準型
CaCl2(無水氯化鈣) 0.10g KCl 0.20g
KH2PO4 0.20g MgCl2·6H2O 0.10g
NaCl 8.00g Na2HPO4·7H2O 2.16g
D-Hanks’ 平衡鹽溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutio, D-H)
KCl 0.40g KH2PO4 0.06g
NaCl 8.00g NaCO3 0.35g
Na2HPO4 0.048g D-Glucose 1.00g Phenol Red 0.01g
消化液：分離組織和分散細胞
— 常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液
— 單獨或混合使用
胰蛋白酶溶液
— 主要作用：使細胞間的蛋白質水解，使細胞相互離散
— 消化細胞時，加入一些血清或含血清的培養液，能終止消化作用
— 胰蛋白酶溶液配制
1、稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks 平衡鹽溶液調成糊狀，再補足D-Hanks 平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4 小時或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩
2、次日，先用濾紙粗濾，再進行過濾除菌，分裝入瓶中， -20℃保存備用（以免分解失效），常用濃度為0.25% （0.1%-0.5%）
3、胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶液調pH 至7.2 左右
EDTA·4Na 溶液
— 一種化學螯合劑，對細胞有一定的離散作用，毒性小，價格低廉，使用方便
— 常用工作液濃度為0.02%。
注意：使用EDTA 處理細胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA 會影響細胞生長
— EDTA 溶液配制：用D-Hanks’ 平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，4℃冰箱保存
pH 調整液
— NaHCO3 溶液
常用濃度為7.5%。配制時用三蒸水溶解后，過濾除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保存
— HEPES（分子量238.31）溶液
1、一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞無毒性
2、主要作用：防止培養基pH迅速變動。在開放式培養條件下，觀察細胞時培養基脫離了5%CO2的環境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養時要添加HEPES
3、使用終濃度一般為10-50mmol/L
4、常配成1M 儲存液：用20ml 雙蒸水溶解4.76克HEPES，過濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4℃保存。使用時可向100ml培養液中加入2ml HEPES濃縮液，終濃度為20mmol/L
谷氨酰胺補充液
— 谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用，合成培養基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加
— 配制好的培養液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養液內，使用終濃度為1-4 mmol/L。
— 一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200 mmol/L（29.22 g/L）
— 配制方法為 ：
谷氨酰胺2.922 g溶于三蒸水加至100ml即配成200 mmol/L的溶液，充分攪拌溶解后（應加溫30℃），過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100 ml 培養液中加入0.5-2 ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4 mmol/L
酚紅
— 大多數培養液中使用酚紅作為pH 指示：
紅色表示中性pH，黃色代表酸性pH，紫色表示堿性pH；
— 在一些特殊培養液中不含酚紅：
因為已有一些研究表明：酚紅能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用
抗生素溶液
— 抗生素使用種類與濃度：
抗生素 工作濃度 儲存溫度 殺滅細菌
penicillin(青霉素) 100 u/ml -20℃ G(+)
streptomycin(鏈霉素) 100 ug/ml -20℃ G(+) 、G(-)
gentamicin(慶大霉素) 50 ug/ml -20℃ G(+)、G(-)、支原體
amphotericin B(潮霉素B) 2.5 ug/ml -20℃ 真菌
nystatin(制霉菌素) 50 ug/ml -20℃ 真菌
哺乳動物細胞冷凍保存
— 冷凍保存要點：
1、冷凍過程要緩慢
4℃ 30－60 分鐘
↓
-20℃ 30 分鐘
↓
-80℃ 16－18 小時（或過夜）
↓
液氮長期保存
2、凍存細胞必須處在對數生長期，活力大于90％，無微生物污染。
3、細胞濃度控制在：1×107－5×107/ml。
— 常用細胞冷凍保存液
10％DMSO ＋ 完全細胞生長培養液（20％血清＋基礎培養液）
10％甘油＋ 完全細胞生長培養液（20％血清＋基礎培養液）
冷凍保存細胞的解凍與復蘇要點
— 快速解凍
1 凍存細胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1分鐘內全部融化（不要超過3 分鐘）；
2 解凍后的細胞可直接接種到含完全生長培養液的細胞培養瓶中直接進行培養，24 小時后再用新鮮完全培養液替換舊培養液，以去除DMSO；
3 如果細胞對冷凍保護劑特別敏感，解凍后的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養液的培養瓶中
— 解凍冷凍保存細胞的離心方法
1 從液氮中取出凍存的細胞，立即放入37℃水浴中快速解凍；
2 將1－2ml 凍存細胞液加入到25ml 新鮮完全細胞生長培養液中，輕輕混勻
3 用80g 離心2－3 分鐘，棄上清液
4 用完全生長培養液輕輕懸浮細胞團，并計數細胞
5 接種細胞到培養瓶中，起始密度為3×105/ml。
lonza 無血清 培養基 火熱促銷之中......點擊如下網址： http://bitebo.com/a/gb2312/gongsixinxi/shichanghuodong/2013/0331/5024.html |
購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物
www.adsraven.com |
|
