細胞培養(yǎng)技術(shù)

1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實驗操作。每 次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間 污染。

實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。

2. 無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。

3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打 開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用， 盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒 感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少Class II)。操作過程中，應避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。

5. 定期檢測下列項目：

5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力

5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。

5.3. 無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(wǎng)(300小時/預濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。

實驗用品

1. 種類︰

1.1. 細胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌制品。

1.2. TC 級培養(yǎng)盤表面均有coating 高分子物質(zhì)以讓細胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依實驗需要使用。

1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml

1.4. 塑料離心管: 15 ml, 50 ml，均有2 種不同材質(zhì)，其中polypropylene (PP) 為不透 明材質(zhì)，polystyrene (PS) 為透明材質(zhì)，可依實驗需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。

1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。

1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml

2. 清洗︰

2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時，洗凈后才開始使用。

2.2. 用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干 凈，勿加清潔劑清洗。

3. 滅菌︰

3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121 oC, 15 lb, 20 分鐘，置于 oven 中烘干。

3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170 oC, 4 小時。

3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121 oC, 15 lb, 20 分鐘處理。

培養(yǎng)基

1. 液體培養(yǎng)基貯存于4 oC 冰箱，避免光照，實驗進行前放在37 oC 水槽中溫熱。

2. 液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳， 可以再添加適量glutamine。

3. 粉末培養(yǎng)基配制(以1 升為例)：

3.1. 細胞培養(yǎng)基通常須添加10 % 血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調(diào)整pH，而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH)，因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。

3.2. 材料：

3.2.1. 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要)

3.2.2. 粉末培養(yǎng)基

3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)

3.2.4. 電磁攪拌器

3.2.5. 無菌血清瓶

3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜

3.2.7. pH meter

3.2.8. 真空幫浦

3.2.9. CO2 氣體

3.3. 步驟：

3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。

3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末(數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異，表一)溶于200ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。

3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合。混后溶液之pH 應為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿，可再通入CO2 氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時， pH 會升高0.1-0.2。

3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于4 oC。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾)

3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試。

4. 配制培養(yǎng)基之生長測試

4.1. 材料：

4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)

4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)

4.1.3. methanol

4.1.4. glacial acetic acid

4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)

4.2. 步驟：

4.2.1. 以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell，接種MDCK 細胞于6-well plate (或35 mm TC dish) 中，每個well 接種1 × 102 活細胞，同時作對照組實驗。

4.2.2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長，待細胞群 落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。

4.2.3. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜置10 min。

4.2.4. 去除固定液，水洗二次。

4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。

4.2.6. 去除染液，水洗二次。

4.2.7. 以肉眼計數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細胞生長不佳，則丟棄之。

抗生素

1. 細胞庫之細胞培養(yǎng)基不加抗生素

1.1. 培養(yǎng)自ATCC 引進之細胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。

1.2. 培養(yǎng)自其它實驗室引進之細胞株，制作token freeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，待 token freeze 通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生素。

2. 寄送活細胞時，須將培養(yǎng)液充滿整個flask 時，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。

3. 若要檢測mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin 會抑制mycoplasma 生長。

4. 去除細菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后藥物毒性會增強。

5. 抗生素使用種類與濃度：

工作濃度. 儲存溫度. 殺滅細菌

penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria

streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria

chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria

gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma

amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds

nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds

fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds

血清

1. 血清必須貯存于–20 ～ -70 oC，若存放于4 oC，請勿超過一個月。如果一次無法用完一 瓶，可將40～45 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中，由于血清結(jié)凍時體積會增加約10 %， 必須預留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。

2. 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加 入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。

3. 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20 oC 或–70 oC 至4 oC 冰箱溶解一天，至室 溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無菌離心管可分裝40～45 ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由–20 oC 直接 至37 oC 解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。

4. heat-inactivation 是指56 oC, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份(complement) 去活化。除非必須，一般不建 議作此熱處理，因為會造成沈淀物之顯著增多，且會影響血清之品質(zhì)。補體參與之反應有： cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis andactivation of lymphocytic and macrophage cell type。

5. 勿將血清置于37 oC 太久，若在37 oC 放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。

6. 血清之沈淀物

6.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性 及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本 身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上 清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因為會阻塞過濾膜。

6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沈淀物的形成會顯著的增多。 有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常會誤認為血清遭受污染，而將血清放在37 oC 中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37 oC 環(huán)境下，又會使此沈淀物增多，更會誤認為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此 小黑點應不會影響細胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應立即停用，更換另一批 號的血清。

7. 血清之生長測試

7.1. 材料：

7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)

7.1.2. a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )

7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish)

7.1.4. methanol

7.1.5. glacial acetic acid

7.1.6. 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)

7.2. 步驟：

7.2.1. 以a-MEM with 10 % FBS (已測試過) 培養(yǎng)MDCK 細胞于T75 flask 至80 % confluency。

7.2.2. 以trypsin-EDTA 處理細胞，離心后，加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM 制成細 胞懸浮液，并測細胞濃度。以不加血清之a(chǎn)-MEM 稀釋細胞濃度為1×102 活 細胞數(shù)/ ml。

7.2.3. 將1 ml 細胞懸浮液接種入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同濃度的血 清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a(chǎn)-MEM，使血清最終濃度為10 % , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測試過之血清同時進行對照組試驗。

7.2.4. 37 oC，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7 天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細胞群落大 到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。

7.2.5. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜 置10 min。

7.2.6. 去除固定液，水洗二次。

7.2.7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。

7.2.8. 去除染液，水洗二次。

7.2.9. 以肉眼計數(shù)群落數(shù)

7.2.10. 計算SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %

7.2.11. 計算RPE(Relative Plating Efficiency)： SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %

7.3. 比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測血清對細胞生長的影響。

7.4. 訂購多量同一批號的優(yōu)良血清，置于–70 oC 保存之

冷凍細胞活化

1. 冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死 亡。

2. 細胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。

3. 材料

3.1 37 oC 恒溫水槽

3.2 新鮮培養(yǎng)基

3.3 無菌吸管/ 離心管/ 培養(yǎng)瓶

3.4 液氮或干冰容器

4. 步驟：

4.1 操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。

4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時 蓋子易松掉。

4.3 將新鮮培養(yǎng)基置于37 °C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。

4.4 取出冷凍管，立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

4.5 取出0.9 ml 解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為 1:10～1:15)，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取0.1 ml 解凍細胞懸浮液作存活測試。

4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO 或glycerol)，依細胞種類而異， 一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10 ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

4.7 若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。

細胞傳代培養(yǎng)

1. 細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3 至1:6，依細胞種類而異。

2. 材料：

2.1. 無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010)

2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于–20 oC，使用前放在37 oC 水槽回溫。

2.3. 新鮮培養(yǎng)基

2.4. 無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶

3. 步驟：

3.1. 附著型胞(adherent cell)

3.1.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。

3.1.2. 用D-PBS 洗滌細胞一至二次。

3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 oC 作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA 溶 液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA 作用后，加入適量含血清 之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。)

3.1.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細胞團塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

3.2. 懸浮型細胞(suspension cell)

3.2.1. 吸出細胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。

3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

3.3. 融合瘤(hybridoma)

3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。

細胞計數(shù)與存活測試

1. 原理：

1.1. 計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coulter counter 粒子計數(shù)器自動計數(shù)。

1.2. 血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber 中細刻9 個1 mm2 大正方形，其中4 個角落之正方形再細刻16 個小格，深度均為0.1 mm。當chamber 上方 蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時，計 數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml 中之細胞數(shù)目。

1.3. 存活測試之步驟為dye exclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色trypan blue 染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。

2. 材料：

2.1. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)

2.2. Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline

2.3. 血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometer and coverslip)

2.4. 計數(shù)器(counter)

2.5. 低倍倒立顯微鏡

2.6. 粒子計數(shù)器(Coulter counter, Coulter Electronics)

3. 步驟：

3.1. 取50ml 細胞懸浮液與50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等體積混合均勻于 1.5ml 小離心管中。

3.2. 取少許混合液(約15ml) 自血球計數(shù)盤chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色(或紅色- Erythrosin bluish)。

3.3. 計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypan blue 等體積混合)，最后乘以104 ，即為每ml 中細胞懸浮液之細胞數(shù)。若細胞位于線 上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。

4 大格*細胞總數(shù)x 2 x 104 / 4= 細胞數(shù)/ml *每一大格的體積= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml

3.4. 若不用血球計數(shù)盤，可用Coulter counter 作自動計數(shù)，惟無法辨別死細胞或活細胞。

3.5. 范例：

T75 monolayer culture 制成10ml 細胞懸浮液，取0.1 ml 溶液與0.1ml trypan blue 混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數(shù)盤，計數(shù)四大方格內(nèi)之細胞數(shù)目。

活細胞數(shù)/方格：55 ,62, 49, 59

死細胞數(shù)/方格：5, 3, 4, 6

細胞總數(shù)= 243

平均細胞數(shù)/方格= 60.75

稀釋倍數(shù)= 2

細胞數(shù)/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106

細胞數(shù)/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106

存活率：225/243﹦92.6 %

細胞冷凍保存

1. 注意事項：

1.1. 欲冷凍保存之細胞應在生長良好(log phase) 且存活率高之狀態(tài)，約為80 – 90 % 致密度。

1.2. 冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma 應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。

1.3. 注意冷凍保護劑之品質(zhì)。DMSO 應為試劑級等級，無菌且無色(以0.22 micron FGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小體積 分裝，4 oC 避光保存，勿作多次解凍。Glycerol 亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。

1.4. 冷凍保存之細胞濃度：

1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml

1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后死去。

1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。

1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106 cells/ml。

1.5. 冷凍保護劑濃度為5 或10 % DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。

1.6. 冷凍方法：

1.6.1. 傳統(tǒng)方法: 4 oC 10 分鐘---> -20 oC 30 分鐘---> -80 oC 16 - 18 小時(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 長期儲存。

1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機以–1 ～ -3 oC/分鐘之速度由室溫降至–120 oC，放在液氮槽vapor phase 長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma 之保存。

2. 材料：

2.1. 生長良好之培養(yǎng)細胞

2.2. 新鮮培養(yǎng)基

2.3. DMSO (Sigma D-2650)

2.4. 無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)

2.5. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)

2.6. 血球計數(shù)盤與蓋玻片

2.7. 等速降溫機(KRYO 10 Series II)

3. 步驟：

3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細胞生長情形。

3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-10%，混合均勻，置于室溫下待用。

3.3. 依細胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細胞，取少量細胞懸浮液(約0.1 ml) 計數(shù)細胞濃度及凍前存活率。

3.4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混 合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。

3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4 oC 10 分鐘→ -20 oC 30 分鐘→ -80 oC 16～18 小時(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 長期儲存。

3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設定程序之等速降溫機中，再放入液氮槽中。程序為: program 7: HB CELL

收到細胞的處理方式

細胞活化︰

1. 收到細胞株包裹時， 請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請立即通知。細胞株請盡速開始培養(yǎng)， 或立即冷凍保存(置于–70 °C， 隔夜后，移到liq N2)。

2. 冷凍細胞解凍程序:

2.1. 依據(jù)細胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例， 制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細胞均無法立即適應不同之基礎培養(yǎng)基或不同之血清種類，若因?qū)嶒炐枰?必須有所不同時， 務必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成， 確定細胞適應后， 方進行所需之實驗。

2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對細胞而言差異極大，請務必依據(jù)細胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。

2.3. 將培養(yǎng)基置于37 °C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之， 移入無菌操作臺內(nèi)。取出冷凍管， 立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿， 否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部， 移入無菌操作臺內(nèi)。

2.4. 依據(jù)細胞種類和濃度，于無菌操作臺內(nèi)取10 ml 培養(yǎng)基加至T25 或T75 flask中。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內(nèi)之培養(yǎng)基， 混合均勻，放入37 °C，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.5. 對絕大多數(shù)細胞而言，1 % 以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除， 待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對極少數(shù)因?qū)MSO 敏感或會造成細胞分化之細胞，需立即去除DMSO 者， 則可將解凍后之細胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養(yǎng)基中，離心300 xg (約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細胞均勻混合后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中， 再放入37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

收到T25 flask 細胞時， 處理方式為︰ 1. 于寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡，T25 flask 均加滿培養(yǎng)基。請檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，若有任何問題，不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。

2. 將原封之T25 flask 靜置于37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱中，使細胞回溫至37 °C， 并 讓運送過程中少數(shù)脫落的細胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養(yǎng)基于flask 內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再將細胞置入培養(yǎng)箱中，或細胞已長滿盤， 則將細胞做傳代培養(yǎng)。

細胞培養(yǎng)FAQ：

1 冷凍管應如何解凍?

取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。

2 細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應馬上去除DMSO?

除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞)， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基?

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活。

4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類?

不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源， 所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養(yǎng)細胞時應使用5 % 或10% CO2?或根本沒有影響?

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2 濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養(yǎng)時應使用10 % CO2;當培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養(yǎng)細胞。

7 何時須更換培養(yǎng)基?

視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。

8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素?

除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。

9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?

一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于–20 °C，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。

10 懸浮性細胞應如何繼代處理?

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可。

11 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉(zhuǎn)速?

欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過高之轉(zhuǎn)速， 將造成細胞死亡。

12 細胞之接種密度為何?

依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

13 細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何?

動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。

14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?

冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況， 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C，避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。

15 冷凍保存細胞之方法?

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微

降低一些。

16 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度?

冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

17 應如何避免細胞污染?

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。

18 如果細胞發(fā)生微生物污染時，應如何處理?

直接滅菌后丟棄之。

19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀?

不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，

無法以其外觀分辨之。

20 支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響?

支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果之數(shù)據(jù)方有意義。

21 偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理?

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。

22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔?

定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

23 為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中，顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性?

培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。

24 各種細胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同?

不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。

25 購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形?

研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少， 大都是因為離心過程操作上的失誤， 造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心， 應待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因?

研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C 太久。

27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因?

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊。

另：這里補充一下培養(yǎng)用品的消毒，供參考：

細胞培養(yǎng)的最大危險是發(fā)生培養(yǎng)物的細菌，真菌和病毒等微生物的污染，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底，由于有關(guān)培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)的失誤均能導致培養(yǎng)失敗，故細胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)都應嚴格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染。

消毒方法分為三類：

(A) 物理滅菌法(紫外線、濕熱、過渣等);

(B) 化學滅菌法(各種化學消毒劑);

(C) 抗生素。

(1)紫外線消毒：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒和培養(yǎng)器皿。紫外線直接照射方便、效果好，經(jīng)一定的時間照射后，可以消滅空氣中大部分細菌，培養(yǎng)室紫外線燈應距地面不超過2.5米，且消毒進物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。

紫外線可產(chǎn)生臭氧，污染空氣，試劑及培養(yǎng)液都有不良影響，對人皮膚也有傷害，不宜近照射也進行實驗操作。

(2)溫熱消毒：即高壓蒸氣消毒，是一種使用最廣泛、效果最好的消毒方法。溫熱消毒時，消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內(nèi)氣體阻塞而千百萬危險，保證其內(nèi)氣體的流通。在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內(nèi)的冷空氣，冷氣空氣排出后，關(guān)閉排氣閥門，同時檢驗安全閥活動自如，繼后開始升壓，當達到所需壓力時，開始記算消毒時間。消毒過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止消毒及表皮意外事件發(fā)生。

常用物品消毒壓力及時間：

培養(yǎng)液、橡膠制品、10磅10分鐘;

布類、玻璃制品、金屬器械、18磅20分鐘。

上兩種是最常見的物理消毒方法。

(3)化學消毒法：最常見的是70%酒精及1‰的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。化學消毒法操作簡單、方便有效。

(4)抗生素消毒：確切應記成抗生素滅菌，主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預防培養(yǎng)物污染。

如果已經(jīng)發(fā)生真菌污染，原則上應盡快丟棄，但是如果是比較珍貴的細胞系，可以用抗真菌藥物來嘗試搶救，用一般用量的5～10倍來沖擊治療，24～28h后換常規(guī)培養(yǎng)液。但是這種方法一般只是在污染早期才有效!

35.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么?

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。

44. 培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎?

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

45.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎?

大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。

46.為什么要在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?

胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。

47.保存血清最好的方法?

我們建議血清應保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃時，請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶，建議無菌分裝血清至恰當?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。

48. 如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損?

將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。

49. 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。

若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。最好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞過濾膜。

50. 為什么要熱滅活血清?

加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學研究，培養(yǎng)ES細胞、平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。

51. 有必要做熱滅活嗎?

實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。

若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時間，更確保血清的質(zhì)量!

52. 為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀?

有些胎牛血清產(chǎn)品沒有預老化，儲存在2-8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質(zhì)量。推薦在-20℃儲存胎牛血清，避免反復凍融。

53. 如何避免沉淀物的產(chǎn)生?

我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作:

(1)解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產(chǎn)生沉淀物。

(2)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(3)請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。

(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

(5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。

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