blueski推薦 [2010-4-15]
出處：審評三部
作者：蔣煜
摘要：由于方法本身的優越性，采用細菌內毒素檢查法取代熱原法的國內申報資料逐年增加，但部分資料仍存在一定缺陷，本文對該法及其影響因素、質控要點等進行簡要評述，以期申請人注意規范對該部分的研究工作。
關鍵詞：細菌內毒素 方法學
熱原檢查法或細菌內毒素檢查法是注射制劑的關鍵質控指標之一。一直以來，熱原檢查在藥物研發中廣泛使用，方法比較成熟，目前藥典和其他國家標準中有很多品種采用熱原檢查，但熱原檢查易受試驗動物個體差異，方法靈敏度、藥物本身性質（某些藥物如乳糖酸紅霉素引起降溫，青霉素往往也有類似作用，兩性霉素B 可引起升溫）等影響，使用受到一定限制；細菌內毒素法系利用鱟試劑與細菌內毒素產生凝集反應的機理，檢測供試品中細菌內毒素的限量的方法，由于方法靈敏度高、準確、快速和經濟等優點，已在各國藥典中得到推廣。當然也仍有部分藥物因為藥物干擾等其他因素無法使用細菌內毒素檢查法。上述兩種方法目前都是可行的內毒素物質檢查方法，在實際應用過程中可以結合藥物本身性質進行選擇。但在審評中發現，由于細菌內毒素檢查法國內研究時間不長，導致部分注冊申請人在藥物研發時對細菌內毒素檢查法的認識上存在一定偏差，本文希望通過對該方法的方法學和限值計算的相關介紹，使研發者增進對細菌內毒素檢查法的認識，提高藥物研發水平。
關于細菌內毒素的研究方法，中國藥典2000年版納入的細菌內毒素檢查法為凝膠法（附錄XI E），在細菌內毒素檢查應用指導原則中（附錄XIX F）提出了濁度法和顯色基質法。即將執行的中國藥典2005年版將兩部分進行了合并，并進行了修訂，納入了凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質法。濁度法是測定凝膠形成過程中的濁度變化，可進一步細分為終點濁度法和動態濁度法，在做細菌內毒素定量測定時，檢測波長一般為360nm。顯色基質法是測定特殊底物釋放出來的生色團，也可分為終點顯色法和動態顯色法，定量測定的檢測波長一般為405nm或545nm。
影響細菌內毒素檢查結果的因素較多，一般包括：試劑因素（鱟試劑、內毒素標準品）；樣品因素（pH值、溫度、離子強度、濃度、可發生鱟試劑反應的非內毒素雜質）和實驗因素（試驗器皿、細菌內毒素檢查用水、鱟試劑的抗干擾能力）等等。中國藥典要求在實驗前必須對試驗器皿進行處理、復核鱟試劑靈敏度、考察供試品干擾試驗等，以排除上述干擾，避免假性試驗結果。上述試驗實際上是方法學驗證過程，以保證該方法的準確性和可信性。
方法確定之后，就需要根據品種用法用量等具體情況測算細菌內毒素限值。內毒素限值指單位藥物（制劑）所含內毒素的最大濃度，中國藥典2000年版和2005年版均采用公式L=K/M計算。其中K指注射途徑內毒素致家兔發熱閾劑量，或病人無任何不良反應的內毒素閾劑量，實際計算時為5EU/kg。M一般可以理解為每公斤體重1小時內給予藥物的最大量（藥物用量或輸液體積）。對于靜脈滴注制劑，通常采用1小時內輸注的劑量，對于皮下肌肉或靜脈注射，一般采用單次劑量計算。例如注射用頭孢哌酮鈉，其臨床單次使用最大量為2g，按60kg、每小時所折算的限度應為0.15EU/mg。在實際操作過程中，根據慣例或者提高藥品質量的要求，一般各國藥典均在上述計算最高限度基礎之上將限度要求提高2-3倍，如中國藥典2005年版注射用頭孢哌酮鈉的細菌內毒素限值即為0.05EU/mg。
以上是細菌內毒素方法和限值計算的簡要介紹。由于GMP的實施、細菌內毒素檢查方法的經濟性、藥檢所檢查的方便性和準確性等因素，目前采用該法的申報資料逐年上升，已逐漸取代了熱原檢查法的地位，這體現了細菌內毒素檢查方法本身的優越性，但部分申報資料中也或多或少存在一定問題，如：僅僅按照中國藥典要求對該項進行檢查，忽視了對方法學的驗證，試驗結果可信度低；另外由于不同廠商生產的鱟試劑其生產工藝、配方、質量參數等存在一定的差異，鱟試劑其抗干擾能力存在差別，但申請人忽視了對鱟試劑的選擇，或對鱟試劑靈敏度的考察。在實驗過程中未考察供試液濃度、pH值的影響，未進行干擾性試驗等致使出現假陰性和假陽性試驗結果；部分申請人未結合藥物具體的臨床用量，設置的細菌內毒素限值要求偏低，無法滿足安全性要求；穩定性考察過程中，不注意選取安全性指標如細菌內毒素項目在最后時間點進行考察，不能對制劑的生物學穩定性有充分的把握；等等。凡此種種，都一方面可能影響申報進度，另一方面也不利于對產品安全性的全面認識，因此我們建議申請人在后續品種的研發和申報過程中，能夠不斷規范對細菌內毒素的研究工作。
以上為個人觀點，希望與大家就此展開進行討論交流，共同提高對細菌內毒素研究工作的認識。
參考文獻
(1) 中國藥學雜志1997年2月第32卷第2期
(2) 中國藥事2000年第14卷第2期
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