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董培智 (山西省藥品檢驗(yàn)所太原 030001 peizhid@263.net)
鱟試劑法是利用鱟血細(xì)胞溶解物與微量(pg/ml級)細(xì)菌(主要是革蘭氏陰性細(xì)菌,G-)的內(nèi)毒素反應(yīng),從而檢出被檢物中內(nèi)毒素的一種生物體外檢測新技術(shù).因?yàn)槠渚哂锌焖佟⒑啽恪⒔?jīng)濟(jì)、靈敏度高、重現(xiàn)性好、一次可同時測幾個樣品等優(yōu)點(diǎn),自從一九六四年美國學(xué)者Levin 和 Bang發(fā)現(xiàn)此法以來[1],鱟法正被日益廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、環(huán)境衛(wèi)生、分子生物學(xué)、以及微生物學(xué)中. 鱟法大致可分為凝膠法、比濁法色原基質(zhì)法、以及免疫法等.本文依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,總結(jié)了近年來國內(nèi)外學(xué)者在用這些方法測定細(xì)菌內(nèi)毒素時發(fā)現(xiàn)的一些影響因素及其消除方法的研究進(jìn)展,以供試驗(yàn)者參考. 1 試驗(yàn)條件與操作培養(yǎng)條件、操作環(huán)境可能引起各次實(shí)驗(yàn)之間、各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果差異[2]. 1. 1 時間 鱟試劑在液態(tài)時極不穩(wěn)定, 室溫放置太久會影響反應(yīng)靈敏度,故加樣結(jié)束后,應(yīng)立即放入恒溫水浴中. [3]延長保溫時間,可提高LAL的靈敏度.[4] 有研究者[5]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品和工作標(biāo)準(zhǔn)品的不同混合時間與相對活性之間具有一定的規(guī)律,即５分鐘時混合點(diǎn)的活性最強(qiáng),混合時間越長,活性反而降低,但在三十分鐘以內(nèi)的各混合點(diǎn)測定的靈敏度均在規(guī)定范圍之內(nèi). 在顯色法中靈敏度與時間有關(guān),故實(shí)驗(yàn)過程中既要嚴(yán)格控制每個環(huán)節(jié)的保溫時間,又要嚴(yán)格控制終止時間[2][6][7]. 1．2 溫度凝膠試驗(yàn)規(guī)定的孵化溫度為37℃.但在夏季高溫季節(jié),如果同時作幾個樣,陽性對照不成立的現(xiàn)象時有發(fā)生,故應(yīng)改為冰浴.[3] 郭錄平[4]通過實(shí)驗(yàn)證明,保溫在25-41℃內(nèi),隨著溫度的升高,LAL的靈敏度也隨著升高；在41-46℃之間,對靈敏度無明顯影響；≥48℃會破壞鱟試劑. 另外在顯色法中的靈敏度也與控制溫度有關(guān)[6][7]. 1.3 pH值 高國政等人[8]用動態(tài)濁度法詳細(xì)研究了樣品pH 值對細(xì)菌內(nèi)毒素測定的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):樣品 pH 在6-8間實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定；pH ≤3 或≥12時,實(shí)驗(yàn)受到抑制,平均回收率≤56.8%.最后得出結(jié)論:使用TAL 時,供試品 pH 應(yīng)預(yù)調(diào)在6.5-7.5 為好；使用 LAL 時,pH 應(yīng)預(yù)調(diào)在6.2±0.1或 6.7-7.8為好. 也有人認(rèn)為[4][7][9] 鱟試驗(yàn)的 pH 應(yīng)為6.5-8.5,以7.0-7.5為佳.必要時可用無內(nèi)毒素的 HCl 或NaOH 調(diào)節(jié) pH 值[2]. 1．4 試驗(yàn)器具 內(nèi)毒素稀釋不宜用注射器,而應(yīng)用經(jīng)過校正的刻度吸管.因?yàn)樽⑸淦骺潭炔粶?zhǔn),而且,針?biāo)ū谀ド趁嬉孜絻?nèi)毒素而使其濃度不夠,造成凝膠反應(yīng)不成立[3][10]. 普通玻璃及塑料管也會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[2][9],用硬的玻璃管及AR玻璃管較為合適.一般硼酸玻璃管測得的效價(jià)較低,而且LAL的靈敏度愈低,管對測定的結(jié)果影響愈大.操作中常用的聚丙烯塑料管可能干擾結(jié)果. 1．5 操作程序有實(shí)驗(yàn)者發(fā)現(xiàn)[3][11]:操作次序也影響試驗(yàn)結(jié)果.應(yīng)該先吸取供試品、然后加入陰性對照及陽性對照液,最后按供試品管、陽性對照管、陰性對照的順序逐一精確加入鱟試劑.未按此程序容易出現(xiàn)陽性反應(yīng)不成立的現(xiàn)象. 1.6 處理作用 Pedersen MR和Hansen EW[12] 將內(nèi)毒素溶液用玻璃試管干燥,在氧丙環(huán)(Ethylene Oxide,EO)450或900mg/l中暴露1-46小時后,內(nèi)毒素的LAL活性減少至百分之三十.將多粘菌素B(Polymyxin B,PB)加入到內(nèi)毒素稀釋液中會減少其活性百分之七十五.內(nèi)毒素經(jīng)過EO處理會減少LAL活性百分之七十,進(jìn)一步加入PB會減少LAL的活性百分之九十九.EO對內(nèi)毒素的反應(yīng)會減少其LAL活性,也會減少其熱源反應(yīng),增加與PB的親和性. Bamba T[13] 等學(xué)者研究了平滑型G-細(xì)菌的內(nèi)毒素(Smooth gram-negative bacteria ,S-form)經(jīng)過高溫蒸氣處理后的滅活效果,觀察到不同種細(xì)菌的抗熱性顯著地不同,減弱率與濃度有關(guān).低濃度(10ng/ml)內(nèi)毒素處理后的活性可降低至可測定的限度下.粗糙型(Rough strains,R-form) 細(xì)菌的內(nèi)毒素減弱時間曲線與個別平滑型相似.平滑型,尤其是Rc突變體(Rc mutant)細(xì)菌的內(nèi)毒素滅活性能夠被Mg2+,Ca2+等二價(jià)陽離子顯著影響. FDA認(rèn)為不同的產(chǎn)品處理和儲存條件可能會引起對某一樣品試驗(yàn)的分析誤差.Guilfoyle DE [14]等人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基以及溶劑的儲藏溫度均不會引起任何問題.然而,因?yàn)槿芤涸谄恐袥]有充分震蕩,溶劑與橡膠塞接觸,約有百分之二十到四十的內(nèi)毒素丟失.解決此問題的方法是應(yīng)將試劑直立地存放在無污染的瓶中,并規(guī)定在內(nèi)毒素試驗(yàn)之前統(tǒng)一的混合步驟. 姜素云等[15]通過考察細(xì)菌內(nèi)毒素的穩(wěn)定性后發(fā)現(xiàn),溶解后的細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)用液(0.5-1.0Eu/ml)在0-4 ℃ 放置一周活性不變；1.0-20Eu 應(yīng)用液若置冰箱,可冷凍保藏20天,但反復(fù)凍融活性會逐漸降低. 2 供試品 2.1 多糖[2] 我們已經(jīng)知道每毫升含皮克級的內(nèi)毒素會使鱟試劑呈陽性,而多于10pg/ml濃度的產(chǎn)堿桿菌多糖(1-3-β-D-葡聚糖)(curdlan,1-3-beta-D-glucan)也會使常規(guī)的內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)呈陽性,因?yàn)長AL中含G因子[16]. 據(jù)報(bào)道[17][18],能激活鱟試劑旁路(G 途徑)的物質(zhì)主要是(1-3)-β-D-葡聚糖(包括(1-4)-β-D-葡聚糖和(1-6)-β-D-葡聚糖)以及LAL-RM(LAL-Reaction Material)兩類,如真菌多糖(Fugal polysaccharide)、中空纖維濾膜洗滌液、腎透析儀(人工腎,血液透析儀)洗滌液等.實(shí)驗(yàn)室常用的酒精,棉球等也含有較多的(1-3)-β-D-葡聚糖.低于一定濃度的(1-3)-β-D-葡聚糖或LAL-RM不足以使鱟試劑的凝集反應(yīng)產(chǎn)生陽性結(jié)果,但如果有細(xì)菌內(nèi)毒素共同作用的情況下,凝集反應(yīng)會變得更為激烈和迅速,很容易使反應(yīng)出現(xiàn)陽性結(jié)果.我國已生產(chǎn)出含有能抑制或阻斷鱟試劑G因子旁路反應(yīng)物質(zhì)的試劑—增抗液(Antienhancement Solution). Cooper JF 和 Weary ME[19] 等學(xué)者發(fā)現(xiàn)商品的LAL試劑對葡聚糖的反應(yīng)存在很大的差異,所以實(shí)驗(yàn)室間LAL實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可能出現(xiàn)矛盾.動態(tài)LAL方法(Kinetic LAL methods)對篩選可能被葡聚糖污染了的物質(zhì)非常有用.葡聚糖在非口服制劑中不常見,只限于被微生物或纖維素物質(zhì)污染的產(chǎn)品.并設(shè)計(jì)了一種能確定葡聚糖存在與否的LAL試驗(yàn)方法. 另外,丹麥科學(xué)家[20]發(fā)現(xiàn),細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑的凝集反應(yīng)可被二甲亞砜與多粘菌素B (dimethyl sulfoxide and polymyxin B)合用,或抗鱟C因子的單克隆抗體(monoclonal antibody against Limulus factor C)所抑制.他們還發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖(beta-glucan)激活途徑能完全被昆布糖(laminarin)所阻礙,而不影響內(nèi)毒素的激活途徑.人血漿與LAL反應(yīng)是通過β-葡聚糖途徑激活的,而非內(nèi)毒素途徑. 八十年代后,日本最先研制成功只與內(nèi)毒素起反應(yīng)的特異鱟試劑,如:Endospecy,以及只與(1-3)-β-葡聚糖反應(yīng)的鱟試劑:SLP試劑及Gluspecy.[21] 2.2蛋白 2.2.1陽離子蛋白 幾位德國科學(xué)家[21]發(fā)現(xiàn)陽離子蛋白(Cationic proteins)如溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G (lysozyme, ribonuclease A, and human IgG)能夠與細(xì)菌內(nèi)毒素形成細(xì)菌內(nèi)毒素-蛋白復(fù)合體,對細(xì)菌內(nèi)毒素有顯著的屏蔽作用,從而影響用鱟法來測定細(xì)菌內(nèi)毒素.試驗(yàn)證明,苯酚提取法、稀釋加熱法、以及高氯酸處理(phenol extraction, dilution heating, and perchloric acid treatment)等方法都不能夠解除此作用.胰島素、糜蛋白酶、鏈酶蛋白酶(trypsin, chymotrypsin, or pronase)等只能回收10%-20%的內(nèi)毒素,然而如在測定之前,用蛋白酶 K (proteinase K)來消化樣品,可使細(xì)菌內(nèi)毒素的回收率達(dá)到百分之百.進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn),多聚-L-賴氨酸及多聚二甲亞胺(poly-L-lysine and poly ethyleneimine)作為細(xì)菌內(nèi)毒素選擇性配位基能夠?qū)⒓?xì)菌內(nèi)毒素從所研究的蛋白上脫去,從而有利于進(jìn)一步的測定. 2.2.2 血蛋白 Roth R與IKaca W 證明[23][24],血紅蛋白能與LPS結(jié)合,這種結(jié)合會改變LPS的一些物理特性,從而增強(qiáng)了LPS的生物學(xué)活性及LPS與LAL的作用. 據(jù)報(bào)道[2][17][18]:人血白蛋白、球蛋白、抗凝血酶Ⅲ均可以激活 G因子.有學(xué)者的研究表明用一般鱟試劑測定的人血白蛋白、球蛋白等血液制品的陽性檢出率明顯高于用去G因子LAL測定的陽性率,而后者與兔熱源檢查結(jié)果基本一致. 2.2.3 免疫蛋白 Baek L[25] 等人通過免疫電泳方法表明,假單孢綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細(xì)胞膜的一些可溶性抗原(Soluble antigens)與LAL能夠反應(yīng). 有的學(xué)者[26]用鼠單克隆免疫球蛋白M抗體E5( mouse monoclonal IgM antibody E5)來測定其抗不同菌種LPS的活性.結(jié)果證明,由于細(xì)菌種類不同,經(jīng)E5處理后,LPS活性減弱的程度也不同,一般地0.2mg/ml以上的E5能減少幾乎所有被研究菌種的LPS對鱟試劑的活性. 另據(jù)報(bào)道 [18], 抗血友病球蛋白、免疫球蛋白也可激活 G 因子途徑. 2.3 離子 離子對細(xì)菌內(nèi)毒素測定結(jié)果影響較大[9],因?yàn)橐环矫骐x子強(qiáng)度較大會引起內(nèi)毒素的聚集,加重低濃度內(nèi)毒素不易散的問題；另一方面LAL中的C因子必須在二價(jià)陽離子的參與下才能被激活形成活化C因子. Guyomard S; Darbord JC [13][27]介紹了用五種內(nèi)毒素,即2株大腸桿菌、1株沙門氏桿菌、1株靈桿菌、1株霍亂弧菌(Escherichia coli, Salmonella, Serratia marcescens and Vibrio cholerae)與FDA推薦的內(nèi)毒素EC5作LAL實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性.發(fā)現(xiàn)添加Mg2+增強(qiáng)了LAL顯色反應(yīng)(160mmol/l最佳),而Ca2+濃度大于5mmol/l時抑制了此反應(yīng),0.3mmol/l的Zn2+會強(qiáng)烈地抑制反應(yīng).由Zn2+的部分抑制作用能被增加Mg2+而減弱(160mmol/l).當(dāng)在反應(yīng)的第一步(細(xì)菌內(nèi)毒素與LAL孵育)時添加這些二價(jià)陽離子會改變LAL顯色反應(yīng),而在反應(yīng)的第二步,即加入生色底物(chromogenic substrate)時這些陽離子則不會改變LAL生色反應(yīng). 據(jù)報(bào)道[7]當(dāng)鱟血被抽出后,用3% NaCl 充分稀釋(1:500)能阻止變形細(xì)胞凝集,即使有內(nèi)毒素存在也不凝聚,但當(dāng)有鈣或鎂離子存在時則很快凝固,由此可知鈣、鎂離子對于鱟試驗(yàn)的作用,但是過量的鈣離子又會影響凝聚作用的完成.因此,當(dāng)溶液中有EDTA等絡(luò)合劑或肝素鈉、檸檬酸鈉等抗凝劑存在時,Ca2+,Mg2+離子將失去作用[2][9],從而影響本法的測定. 有人在研究內(nèi)毒素的電催化特性對于鱟試驗(yàn)的影響時,證明釷與鐵對內(nèi)毒素的活性有強(qiáng)烈的影響,但由于其在鱟血中的含量甚微,故并不干擾實(shí)際測定.[7] 生理鹽水中的 NaCl 對顯色反應(yīng)有干擾[28],但關(guān)鍵在于稀釋樣品和標(biāo)準(zhǔn)品須用相同的無熱源水或無熱源生理鹽水. 相反,許多藥物中含有的陰離子會吸收鱟試劑中的 Ca2+、Mg2+離子,使實(shí)驗(yàn)呈假陰性,可通過加入0.5mg/ml的氯化鈣溶液,或22mg/ml的氯化鎂溶液來排除干擾.[29] 2.4 有機(jī)鹽 核酸鈉(Sodium Nucleinate,NN)像細(xì)菌內(nèi)毒素的LPS一樣能夠被LAL試驗(yàn)所檢測,有學(xué)者[30]還比較了含有NN熱原標(biāo)準(zhǔn)品的兔法與LAL法的測定結(jié)果. 2.5 透析液 Berland Y[31]總結(jié)了在文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)中有關(guān)透析液細(xì)菌性污染的資料.透析液中的G-小分子熱源物質(zhì)能夠透過正常的透析膜.纖維性透析膜(Cellulosic hemodialysis membranes)比合成膜(synthetic membranes)更容易通過內(nèi)毒素.聚砜膜及聚酰胺膜(Polysulfone membranes and polyamide membranes)在透析液的那一面能夠吸收內(nèi)毒素.所以,鱟試驗(yàn)不能夠檢出污染透析液的所有細(xì)菌性物質(zhì). Laude-Sharp M[32]等人的實(shí)驗(yàn)證明:在體內(nèi)具有生物活性的多種LPS能夠通過透析膜,盡管在血液中沒有測到LAL反應(yīng)物質(zhì),所以LAL法作為測定生物液(biological fluids)中是否存在LPS的標(biāo)準(zhǔn)不夠充分. 日本學(xué)者 Yoshioka T [33]等人通過使用無G因子的凝集系統(tǒng)證明了從銅氨人造纖維膜(cuproammonium rayon membranes)得到的LAL反應(yīng)物質(zhì)不是內(nèi)毒素,而是通過另一種途徑使LAL凝集,此物質(zhì)在循環(huán)中滯留相當(dāng)長的時間.并發(fā)現(xiàn)在急性及慢性血液透析中,此反應(yīng)物質(zhì)平均水平為100-400pg/ml. 仲衛(wèi)華[34]等的實(shí)驗(yàn)證明,血液透析液有一定的干擾作用,但可通過稀釋法消除. 以上研究結(jié)果說明用鱟試劑來測定透析液中的內(nèi)毒素的方法還有待于進(jìn)一步的考察. 2.6 中藥成分[21] 許多種中草藥成分能夠干擾LAL試驗(yàn)[35],特別是清熱解毒類藥物[29]. 2.7 生化藥品[21] 姜素云[2][36]等證明,氨基酸對鱟試劑有較強(qiáng)的抑制作用. 孔祥文[28]通過實(shí)驗(yàn)證明,基因工程蛋白類藥物生產(chǎn)中常用的 2-巰基乙醇、2-巰疏糖醇和還原性谷胱甘肽對鱟試驗(yàn)呈色反應(yīng)有干擾作用,當(dāng)稀釋到5.0μmol/l時,抑制作用近乎消除. 2.8 其它物質(zhì)另據(jù)報(bào)道[2][9][21][29]:人血中的多種凝血因子、可使蛋白質(zhì)變性物質(zhì)(乙醇、苯酚)或滅活的物質(zhì)(如氧化劑、抗氧化劑、蛋白水解劑、專一失活劑等)、高糖溶液、絡(luò)合物、電解質(zhì)、維生素、添加劑、右旋糖酐-40、抗凝血劑如檸檬酸及肝磷脂等等,都可干擾鱟試劑形成凝膠.
3鱟試劑與標(biāo)準(zhǔn)品 3．1 鱟試劑內(nèi)源性因子 Roth RI與Tobias PS[37]在研究含有能被細(xì)菌內(nèi)毒素激發(fā)引起凝集反應(yīng)的內(nèi)毒素敏感因子的鱟試劑色析組份(chromatographic fraction of Limulus lysate)時,用了一種光復(fù)活性的、易解離的、放射性同位素標(biāo)記(photoreactive, cleavable, radiolabeled)的沙門氏菌LPS衍生物(derivative of Salmonella minnesota LPS),LPS-(P-疊氮水楊酰胺)-1,3-二硫丙胺(LPS-(p-Azidosalicylamido)-1,3'-Dithiopropionamide ,LPS-ASD),來確定LPS-結(jié)合蛋白.結(jié)果證明LAL組分中較大的82-kDa蛋白是LPS結(jié)合蛋白,充當(dāng)凝集反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子,LAL組分中較小的50-kDa蛋白是對LPS敏感的凝集蛋白的選擇物. 日本科學(xué)家[38][39][40]發(fā)現(xiàn)在日本馬蹄蟹(horseshoe crab (Tachypleus tridentatus))血細(xì)胞中存在鱟胞間凝集抑制物(Limulus Intracellular Coagulation Inhibitor,LICI)1型、2型、及3型.LICI-1專一性抑制對鱟LPS-敏感的絲氨酸蛋白酶(limulus lipopolysaccharide-sensitive serine protease),C因子(K1=2.5×106 M-1,S-1)；而LICI-2顯著抑制鱟凝集酶(limulus clotting enzyme)(K1=4.3×105 M-1,S-1)；LICI-3強(qiáng)烈抑制對(1,3)-β-D葡聚糖敏感的絲氨酸蛋白酶((1,3)-beta-D-glucan-sensitive serine protease),G因子(K1=3.9×105 M-1,S-1).因此,鱟血淋巴凝結(jié)過程至少由三個內(nèi)源性因子所調(diào)節(jié):LICI-1 是Mr=48,000,有394個氨基酸的單鏈糖蛋白,其單一反應(yīng)位點(diǎn)為-Arg-Ser-; LICI-2 是Mr=42,000,有386個氨基酸的單鏈糖蛋白,其單一反應(yīng)位點(diǎn)為-Lys-Ser-; LICI-3 是Mr=53,000,有392個氨基酸的單鏈糖蛋白,其單一反應(yīng)位點(diǎn)與LICI-1相同. 3．2 試劑質(zhì)量 不同批號的鱟試劑標(biāo)示值相同,但試驗(yàn)結(jié)果不盡相同,尤其是近效者的靈敏度有明顯下降的趨勢.所以在更換批號或者用近效期鱟試劑的時候,應(yīng)對靈敏度進(jìn)行復(fù)核.以確定本批鱟試劑的實(shí)際靈敏度.[3] 有的同志發(fā)現(xiàn)[11]:使用不同廠家生產(chǎn)的溶解水來溶解鱟試劑,結(jié)果會導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn),而使用同廠生產(chǎn)的鱟試劑及溶解水均符合規(guī)定. 另外,還有試驗(yàn)者發(fā)現(xiàn)[41][42][43]:不同廠家與批號的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度有很大的差別,有的竟低于50% 以下.支與支之間差異竟達(dá)50%.[10] 高麗云[44]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)如放置半年后重新標(biāo)定, LAL靈敏度會下降,細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)低于標(biāo)示量.這可能與細(xì)菌內(nèi)毒素的處方、pH值、冷凍干燥過程以及凍干標(biāo)準(zhǔn)品中加入的如人清蛋白、乳糖、聚乙二醇等添加劑影響細(xì)菌內(nèi)毒素的穩(wěn)定性有關(guān)[2]. 參考文獻(xiàn): 1 Levin,J,and Bang, F. 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注:本文發(fā)表在《藥物分析雜志》1999.19卷增
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