柯薩奇病毒(Coxsackie viruses簡稱Cox.病毒)是1948年Dalldorf等采用新生小鼠研究脊髓灰質(zhì)炎病毒時，在紐約附近的Coxsackie分離發(fā)現(xiàn)的一種腸道病毒，屬小RNA病毒科，可分為A、B二組.A組有23型(A1-22，24)，B組有6型(B1-6)，與A組的A9型有共同的組特異性抗原.Cox病毒可引起許多不同的臨床癥侯，甚至同一病毒可以引起不同的疾病(表1)，近年通過PCR技術(shù)證明，除可導(dǎo)致腦炎、腦膜炎外，是心肌炎、心包炎的重要病原，其持續(xù)感染可能與特發(fā)性擴張型心肌病密切相關(guān).本文簡述PCR技術(shù)在Cox病毒檢測中的應(yīng)用.

一、Cox病毒基因與PCR引物設(shè)計

　　Cox病毒為腸道病毒屬，其基因結(jié)構(gòu)具有小RNA病毒科的共同特征(如圖所示)，可分為衣殼蛋白基因區(qū)，無性繁殖功能區(qū)和非編碼區(qū)，其5'-末端即位于衣殼蛋白基因外的堿基序列同其他小RNA病毒具有較高的交叉性.

病毒感染引起的主要臨床癥侯

　　目前，根據(jù)Cox病毒基因的序列研究結(jié)果，人們選擇高度保守的編碼區(qū)和5'非編碼區(qū)(如nts461-640)，已設(shè)計了多對引物，用于Cox病毒A組和B組的擴增及特異性擴增CoxB3病毒.但由于Cox病毒與其小RNA病毒基因之間有高度的同源性(70-90%，位于VP1基因)，目前設(shè)計的引物除CoxB3病毒特異性引物外，其余的引物均可用于擴增CoxA組和B組病毒，并同脊髓灰質(zhì)炎病毒有較高的交叉反應(yīng).

Cox病毒PCR擴增所用引物及探針

二、標本的采集和處理

　　按常規(guī)方法收集鼻咽分泌物、糞便、心肌活檢材料及腦脊髓液等標本后，應(yīng)在0-4℃條件下立即送實驗室，分裝保存于-20℃或提取模板.由于體液和組織中RNase含量較高，影響制備病毒RNA，故在制備RNA前應(yīng)按100Ul標本中加40U的RNase酶抑制RNasin.

三、模板RNA制備

　　1.酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿法:適用于從心肌等活檢標本或細胞培養(yǎng)標本.①先將標本(1.5mm3)或1×10⁷細胞研磨勻漿，加入1ml裂解液(4mol/L異硫氰酸胍-25mmol/L檸檬酸鈉PH7.0，50mmol/L2-硫基乙醇，0.5%Sarkosyl)，混合后冰浴中作用15min.②分別加入1/10體積的2mol/L NaAc(PH4.0)，等體積飽和酚，2/10體積的氯仿，混合作用15S.③15000r/min離心15min，收集水相，加入等體積的異丙醇，1-20℃2h，再次離心，用75%乙醇洗一次，收集RNA沉淀.

　　2.酚-氯仿抽提法:適用于從體液標本中制備RNA.①取體液標本100 Ul于反應(yīng)管中加入2%，使終濃度為0.5%，再與等體積的酚:氯仿(1∶1)混交，15000g離心15min，收集上層水相.②再向原反應(yīng)管的有機中加入含0.5%SDS的TNE溶液(10mmol/L Tris-HCL PH7.5，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA)，提取一次，同上離心，收集水相.③將兩次收集的水相合并，加入NH₄AC溶液，使以濃度為2mol/L，加2.5倍體積的冷無水乙醇，-20℃置2h以上，15000g離心(4℃)30min，棄上清，收集沉淀，用20UlTE(PH7.5)稀釋(含40U的RNasin).

四、逆轉(zhuǎn)錄

　　取5Ul RNA提取模板加入20Ul反應(yīng)混合液(含50mmol/L Tris-HCl PH8.4，6mmol/LMgcl₂，10mmol/L DTT，50mmol/L NaCl，250mmol/L的dATP，dCTP、dGTP、dTTP，1umol/L下游引物P2)及40U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶;再加25-50Ul礦物油封頂后于42℃反應(yīng)1h，使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.

五、PCR擴增

　　①取上述逆轉(zhuǎn)錄后的反應(yīng)混合物20Ul，加PCR反應(yīng)液至100Ul反應(yīng)體積.PCR反應(yīng)液含有終濃度為50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl PH8.4，1mmol/L MgCl₂，100Ug明膠，引物1和引物各1U mol/L及四種dNTP各200U mol/L.

　　②混勻后，94℃水溶5min，冷至55℃.

　　③加入2.5U Taq聚合酶，振蕩搖勻，用100 ul礦物油封頂.

　　④94℃變性2min，55℃退火2min，72℃延伸2min，重復(fù)35個循環(huán).最后于72℃延伸10min.

　　⑤為提高某些標本檢測的敏感性，可取第一次擴增產(chǎn)物1Ul，作模板，加入PCR試劑進行第二次擴增(20-25個循環(huán)).

六、擴增產(chǎn)物的檢測

　　(一)電泳法:取10Ul的PCR產(chǎn)物于1%或2%瓊脂糖凝膠上電泳，以EB染色顯示PCR產(chǎn)物，如出現(xiàn)與目的片段大小相同的擴增產(chǎn)物，則判為陽性.

　　(二)雜交法:

　　1.將PCR產(chǎn)物與等體積的0.6mol/L NaOH混合，室溫作用15min后，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上.

　　2.用100Ul 2mol/L，NH₄AC溶液中和后，將濾膜置真空爐中烘烤2h.

　　3.將膜置于5XSSC-1%SDS-0.5%BSA的緩沖液作預(yù)雜交.

　　4.再于含50U l0.4Umol/L堿性磷酸酶標記探針的預(yù)雜交液中，45℃，15min.

　　5.用1%SDS-1×SSC液及1%TritonX-100液100ml，先后各洗2次，再用1×SSC洗1次.

　　6.將濾膜浸入7.5ml堿性磷酸酶混合物中室溫顯色3-4h，然后雙蒸水洗滌，終止反應(yīng).

七、應(yīng)用和發(fā)展

　　目前，應(yīng)用上述引物，可進行Cox病毒感染的診斷，特別是用CoxB3病毒的特異引物，擴增病人心肌活檢標本中該病毒的核酸，具有很高的敏感性和特異性，同其他Cox病毒及小RNA病毒無交叉反應(yīng)，并證明CoxB3是心肌炎的重要病原，同原發(fā)性擴張型心肌病密切相關(guān)，故隨著此技術(shù)的深入應(yīng)用，將有助于揭示上述心臟病的真正病因.當(dāng)然，目前PCR引物的設(shè)計還需進一步解決Cox病毒A組、B組特異性引物及型特異性引物問題，這樣才能進一步用于臨床診斷及分子流行病學(xué)的研究，同時也有助于了解Cox病毒變異的規(guī)律，為研制預(yù)防用的疫苗奠定基礎(chǔ).

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