經(jīng)典型的苯丙酮尿(Phenyketon uria簡(jiǎn)PKU)是由苯丙氨酸羥化酶(PAH)的遺傳性 缺陷引起的一種先天性代謝病，其發(fā)病早在我國(guó)以為1/10000左右，雜合子頻率為 1/50.

PKU的臨床表現(xiàn)

　　PKU患兒由于苯丙氨酸羥化酶的缺乏或不是使苯丙氨酸在休丙大量堆識(shí)，并經(jīng)旁 路代謝途徑產(chǎn)生一系列的毒性代謝產(chǎn)物而該小兒產(chǎn)生一系列的明顯中毒癥狀.患兒在 剛出生時(shí)，由于無(wú)苯丙氨酸的攝入因此無(wú)臨表現(xiàn).隨著患兒的退食而連續(xù)出現(xiàn)智力進(jìn) 行性下降，皮膚色素淺，肌張力高，驚厥發(fā)生，汗和尿中有特殊的臭味，最經(jīng)生活不 能自理，智力嚴(yán)重障礙.

PKU的遺傳學(xué)

　　PKU是一種常染色體隱性遺傳病，患兒的父母為致病基因的攜帶者而患兒為純合 子.引起PKU的基因的PAH，該基因位于12q22-24.2全長(zhǎng)約90kb，包括13個(gè)外顯子和12 個(gè)內(nèi)含子.內(nèi)切酶解分析顯示PAH的完整cDNA其有8個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶切點(diǎn)，形成10個(gè) RFLP.在人群中這些RFLP可組成1536種單倍型.過(guò)去對(duì)PKU的診斷即用此連鎖分析.另外 在PAH基因內(nèi)含有數(shù)個(gè)VNTR和STR.外顯子3'鎖700bp處有-(TCTA)重復(fù)序列，外顯子 133'端下游3kb內(nèi)有-30bpVNTR，它們?nèi)杂惺畴s的遺傳病多態(tài)現(xiàn)象，可用為連鎖分析時(shí) 的標(biāo)記.

PAH基因突變類(lèi)型

　PAH基因的突變常見(jiàn)的有兩種類(lèi)型即缺失和單堿基置換，在我國(guó)人群中，已檢測(cè)的 PKU均因PAH基因的單堿基量換所致.目前在我國(guó)其檢出了15種以上的點(diǎn)突變6見(jiàn)表，這 些點(diǎn)突變?cè)谖覈?guó)南方和北方人群中的頻率有的不同.因此在PKU的診斷中注意這種差別.

中國(guó)人已檢出的PAH基因點(diǎn)突變

PAH基因點(diǎn)突變的PCR檢測(cè)

(一)PCR-ASO斑點(diǎn)雜交

　　在我國(guó)人群中，目前所發(fā)現(xiàn)的PAH基因突變以點(diǎn)突變?yōu)橹鳎虼丝梢源藖?lái)合成相 應(yīng)的突變型寡核苷酸探針.來(lái)檢測(cè)PKU患者的點(diǎn)突變，ASO法是最為有效的點(diǎn)突變檢測(cè) 技術(shù).隨著非同位素標(biāo)記探針的出現(xiàn)及反向斑點(diǎn)雜交的應(yīng)用，預(yù)記該方法的臨床應(yīng)用 將愈來(lái)愈廣泛.下表訓(xùn)列即為利用PCR-ASO檢測(cè)時(shí)所用的引物.

探針

　　擴(kuò)增時(shí)所用引物系根據(jù)每個(gè)外顯子兩側(cè)的旁側(cè)序列的設(shè)計(jì).擴(kuò)增片段包括完整的 外顯子區(qū)域其兩側(cè)部分內(nèi)含子序列.

(二)3'-堿基特異PCR，高位特異PCR

　　在以PCR為主的已知突變檢測(cè)中，3'BSPCR是最簡(jiǎn)便可行的一種檢測(cè)技術(shù).在應(yīng)用 時(shí)，采用正常引物和突變引物兩組試驗(yàn)，以確定何種引物可擴(kuò)增，然后電泳確定有無(wú)相應(yīng)的突變. 由個(gè)PAH各外顯子間的距離較大，各自有獨(dú)立的引物，因此可用多重PCR同時(shí)擴(kuò)增數(shù) 個(gè)外顯子.不應(yīng)同時(shí)，可將正常引物編為一組，突變引物編為一組進(jìn)行兩組多滲PCR. 然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物以確定突變位點(diǎn).

　　表所到即為國(guó)內(nèi)報(bào)道的用等位特異PCR

診斷PKU后用的相物及擴(kuò)增片段，檢測(cè)位置

(三)用PCR直接檢測(cè)發(fā)生點(diǎn)突變的內(nèi)切酶點(diǎn)

　　在PKU已檢出的突變位點(diǎn)中，有七個(gè)位點(diǎn)的突變改變了限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn). 若用該酶切位點(diǎn)兩側(cè)的引物擴(kuò)增包括內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)在內(nèi)的DNA的酶，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶 溶解，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離酶切點(diǎn)段，以判定個(gè)體有無(wú)該內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的突變，引起內(nèi)切酶識(shí)別 位點(diǎn)改變的點(diǎn)突變見(jiàn)

(四)新的突變位點(diǎn)的PCR篩查:

　　對(duì)于有患者，不夠用上述的PCR方法檢出其突變位點(diǎn)，則可用PCR-SSCP，PGGE、 CDGE及其它的突變位點(diǎn)篩查技術(shù)進(jìn)行篩查，以確定檢出的突彎位點(diǎn)與PKU的關(guān)系.

PKUPCR診斷的途徑

　　(一)利用PCR-ASO檢測(cè)，近年來(lái)又發(fā)展了反向點(diǎn)雜交及非同位標(biāo)記探針，與PCR-A SO應(yīng)用起來(lái)更為方便，它是檢測(cè)PKU點(diǎn)突變的最為手段之一.

　　(二)利用等位特異PCR(ASPCR)

　　若將ASP-PCR與多重PCR結(jié)合，形成MASP-PCR則一見(jiàn)可檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)，要是一 個(gè)非常有效的PKU診斷手段.

　　(三)利用PCR-RFLP診斷

　　由于某些突變涉及到酶切位點(diǎn)的變化，因此右PCR-RFLP進(jìn)行診斷PKU.

PCR在PKU的產(chǎn)前診斷斷中的應(yīng)用

　　由于PKU的治目前沿?zé)o有效的方法，因此其產(chǎn)前診斷，防止PKU患兒的出生具有重 要的意義，在PKU的產(chǎn)前診斷中，RFLP是較為傳統(tǒng)的診斷方法，操作費(fèi)時(shí)，不能及時(shí) 提供臨床診斷信息，而且有相當(dāng)大的一部分不能提供信息加止還要用同位素標(biāo)記的探 針進(jìn)行操作，因而大大的限制了其原因，應(yīng)用PCR技術(shù)診斷PKU快速準(zhǔn)確，易于滿(mǎn)足臨 床需要，而是便于推廣應(yīng)用.

(一)，PCR-ASO

　　傳統(tǒng)的PCR-ASO及類(lèi)似的診斷方法盡管準(zhǔn)確有效，但操作復(fù)雜，往往需要進(jìn)行多 次操作，確診一測(cè)頗為費(fèi)時(shí)，近年來(lái)應(yīng)用的反向點(diǎn)雜交法(reverse dot bolt RDD)， 改變了傳統(tǒng)的點(diǎn)雜交程序，因而該其檢測(cè)時(shí)程明顯縮短，操作也較簡(jiǎn)化.RDB是將一系 列的ASO探針先固定于膜上，然后用擴(kuò)增的靶DNA與之雜交，在應(yīng)用時(shí)，可將一些較為 常見(jiàn)的點(diǎn)突變探針固定于同一膜，而少見(jiàn)的固定于同一膜，因此結(jié)束分析樣品最多只 需雜產(chǎn)兩次即可完成PKU的診斷，在這種情況下，即使無(wú)證者一亦可進(jìn)行產(chǎn)前診斷.

(二)MASP.PCR

　　采用MASPPCR亦是進(jìn)行已知PAU突變點(diǎn)基因產(chǎn)前診斷的簡(jiǎn)易方法之一.

(三)AmPFLP+PCR-SSCP快速診斷

　　盡管采用PCR-ASO和MASP-PCR可檢測(cè)全部的常見(jiàn)的PAH基因的已知點(diǎn)突變，但它只 能診斷約70～80%的PKU患者及浸入，仍有相當(dāng)一部分不能同上述方法進(jìn)行產(chǎn)前診斷， 我國(guó)董尚志等人利用PAH是國(guó)內(nèi)的STP及VNTR作為多態(tài)性標(biāo)記結(jié)合PCR-SSCP進(jìn)行產(chǎn)前診 斷，其診斷的準(zhǔn)確率可達(dá)90%左右診方法包括以下幾步.

　　1.Amp-FLP連鎖分布：等用PAH基因內(nèi)含子中-STR多態(tài)性進(jìn)行分析，可次66.2%的家之獲得有用的診斷信 息，其引物序列為:可擴(kuò)增片段大小范圍為，擴(kuò)增完畢合用變性膠(尿素)PAG電泳分析 擴(kuò)增長(zhǎng)產(chǎn)物的片段多態(tài)性和先證者及攜帶者對(duì)照，確定胎兒的基因組合，以判斷是否 為PKU患兒，若用連鎖分析不能診斷則進(jìn)入下步

　　2.外顯子4PCR-SSCP

　　3.外顯子7，11，12SSCP分析：通過(guò)上述3步分析，診斷常可達(dá)90%以上，該方法簡(jiǎn)使快速，準(zhǔn)確率多，極適合于 基礎(chǔ)應(yīng)用.若將PCR-ASORDB與Amp-FLP聯(lián)合應(yīng)用，則定確率定高，況且要進(jìn)行雜交，條 件及探治相對(duì)復(fù)雜，因此尚不夠廣泛推廣于臨床檢測(cè).

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