骨腫瘤較罕見，惡性骨腫瘤只占全身惡性腫瘤的1%，男多于女，性別比約為1.6 ∶1，均好發于10-30歲間，良性者以骨軟骨瘤最多，依次為骨巨細胞瘤、內生軟骨瘤 等，惡性者以骨肉瘤最多，依次為軟骨肉瘤、纖維肉瘤等.骨惡性腫瘤的發生機理目 前認為是癌基因顯性作用與抗癌基因失活的結果，是多種癌基因多階段多途徑協同作 用的結果.骨惡性腫瘤轉移涉及到腫瘤細胞自身與宿主細胞之間錯綜復雜的關系，受 多種相關基因的調控，即腫瘤的轉移與轉移基因和轉移抑制基因有關，與生長因子及 其受體的表達以及某些癌基因產物有關.因此，通過對活化的癌基因及抗癌基因改變 的檢測，可以快速分析患者腫瘤的易感性及判斷腫瘤的預后;檢測耐藥基因的表達程 度，可為腫瘤的診治提供方案選擇的依據;通過對轉移基因及轉移抑制基因的檢測， 可以判斷腫瘤有無轉移，對手術治療案提供依據.

　　PCR技術是一門新型快速診斷技術，具有敏感、特異、專一性強等特點，在骨腫 瘤診斷及研究方面具有其它方法難以比擬的優越性.

一、PCR技術在骨腫瘤診斷中的應用

　　骨腫瘤診斷需要解剖學、組織學和胚胎學等基礎知識，對病變需認真觀察，仔細 分析，但更重要的是對臨床資料及X線所見要特別重視.骨腫瘤形態變異較大，而臨床 X線觀察較全面，病理鏡檢有一定局限性，而一些癌基因改變是與某一型骨腫瘤密切 相關，即為腫瘤特異性基因，因此在骨腫瘤診斷方面在堅持臨床、X線及病理三結合 的診斷原則基礎上，通過PCR技術對腫瘤特異性癌基因變化的檢測，可以更好地輔助 骨腫瘤的診斷，具有其它方法不可代替的優越性.

1.成骨系統腫瘤的診斷

　　本系統中惡性腫瘤最多見的是骨肉瘤，由于骨肉瘤類型繁多，有多方向分化特 點，故形態復雜，除常見的成骨型、成軟骨型、成纖維型外，尚有較罕見的惡纖維 型、血管擴張型、小圓細胞型，髓內高分化型和富于巨細型的骨肉瘤.骨肉瘤雖多由 髓內發生，但也可由骨外膜發生，向外生長形成骨表面骨肉瘤.骨表面骨肉瘤近年來 又根據其形態及惡性度的不同分成四個亞型，盡管各型有其形態特征，但在常規診斷 時還是有不少被誤診.腫瘤生物學研究表明，骨肉瘤中細胞DNA含量明顯高于正常細 胞，并具有一系列癌基因的改變，如骨肉瘤中75%的P53基因突變，mdm2、c-myc及 c-raf擴增，TPR-met重排等.

　　首先，我們可以用定量PCR方法檢測細胞中DNA含量，來判斷腫瘤的良惡性，接 著，利用多重PCR或巢式PCR檢測P53、mdm2、c-raf、met等的基因改變，來確診是否 為骨肉瘤，同樣可以利用數種骨肉瘤特異的單克隆抗體，采用免疫PCR方法對骨肉瘤 進行診斷及分型.隨著nm生物學技術的發展，可以利用原位PCR方法，先確定好特異性 癌基因產物的位置，然后在透射電鐿下動態觀察其形態及結構，這樣可以更好地確診.

2.軟骨系統腫瘤的診斷

　　軟骨腫瘤的惡性程度除與細胞異形性有關外，和腫瘤發生部位及其體積大小亦密 切相關.發生在近心端的如骨盆、肩胛等直徑大于6cm者，即使細胞異形性不太明顯， 也可能為高分化軟骨肉瘤，反之若腫瘤發生在遠端，雖細胞較密集有中等程度異形 性，但一般顯示良性生物學行為，可診斷為良性腫瘤.軟骨腫瘤分類也十分復雜，根 據形態學診斷易誤診，從基因水平來診斷更符合實際情況.首先要區分是良性腫瘤還 是惡性腫瘤，運用定量PCR方法，檢測細胞中DNA含量，可以判斷良惡性.其次，要與 骨及其它組織腫瘤相鑒別.研究表明，Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、骨形成蛋白、骨鈣素、 骨連接蛋白等均為骨特異性蛋白，運用定量PCR方法，檢測相應基因的表達程度可以 確定其組織來源，同樣也可以利用相應的單克隆抗體，采用免疫PCR方法確定其組織 來源及分型.

3.骨惡性腫瘤轉移的診斷

　　近幾年的研究表明，癌基因mdm2的擴增與骨惡性腫瘤的轉移密切相關，mn23-H1 在轉移的骨惡性腫瘤中呈低表達，在分化良好的腫瘤中呈高表達.因此，運用定量PCR 方法檢測癌基因mdm2擴增程度，以及mn23-H1的表達程度可以判斷骨惡性腫瘤有無轉 移.

4.骨惡性腫瘤治療效果的判斷

　　近幾年的研究表明，微小轉移灶在骨惡性腫瘤發生后不久就存在于周圍的血液循 環中，骨腫瘤的手術治療只能解決局部問題，而微小轉移灶的清除必須依賴于放療、 化療或免疫治療，因此，檢測外周血中有無微小殘余病灶，可以判斷治療效果，并對 是否需要繼續治療提供依據.

二、PCR技術在骨腫瘤研究中的應用

1.在骨腫瘤發病機理研究中的應用

　　骨惡性腫瘤是多種癌基因多階段多途徑協同作用的結果，到目前為止，發現與骨 惡性腫瘤密切相關的癌基因有K-ras、c-fos、proα-1、proα-2、c-sis、c-raf、 c-myc、met、mdm2，抗癌基因有Rb、P53、P16等.發現的癌基因已有100多個，抗癌基 因有8個，它們當中究竟還有哪些與骨惡性腫瘤發生發展有關，仍有待于進一步研究. PCR技術是一門快速診斷技術，尤其是PCR相關技術的發展，給分子水平的研究帶來了 一場革命.使研究的效率大大提高.

　　①骨惡性腫瘤中癌基因突變、缺失、重排的研究癌基因突變重排常導致腫瘤的發 生，因此檢測癌基因的改變對研究骨腫瘤發生機理具有重要意義.傳統的方法是提取 DNA，走電泳，轉移到NC膜上，再用標記的探針進行雜交，檢測缺失、重排、突變.方 法比較繁瑣，放射性同位素對人體亦有害，而PCR技術利用一對引物就可以把待檢的 DNA片段擴增出來，再利用RFLP技術或SSCP技術就可以檢測出有無重排、缺失、突 變，既方便快速，又對人體沒有任何傷害.

　　②骨惡性腫瘤中癌基因擴增與表達的研究　特異性癌基因的擴增與高表達常導致骨腫瘤的發生，找出這種特異性癌基因對骨 惡性腫瘤的發病機理的研究具有重大理論意義，同時，也給臨床診斷骨腫瘤帶來特異 性指標.傳統的研究方法首先要提取DNA或RNA進行紫外定量，并用尿素變性電泳鑒定 有無降解，然后再轉移或打點至NC膜上，用相應的標記好的探針進行雜交，放射自顯 影，最后進行灰度掃描來定量，這種研究方法最快也得需要二周時間，而定量PCR技 術則只需50-80ng的模板DNA或RNA，擴增25個循環，就可以從計算機中打印出結果， 得出原始模板當中某個癌基因的拷貝數，可以直接判斷出有無某種癌基因的擴增與高 表達.運用PCR方法篩選這種特異性癌基因，方法簡便，快速，在較短的時間內可以完 成相當大的工作量.

　　③骨惡性腫瘤特異性抗原基因的篩選研究　十多年來對骨惡性腫瘤細胞株的研究表明，骨惡性腫瘤中存在一些特異性抗原與 相關性抗原，并且已經研制成了一些特異性單克隆抗體，但是到目前為止，尚未有人 篩選出骨惡性腫瘤特異性抗原的基因，傳統的研究方法是首先從大量腫瘤組織中提取 腫瘤抗原，然后免疫動物，取脾臟等與雜交瘤融合，再從陽性克隆中篩選特異性的單 克隆抗體.這種單抗，運用于人體仍然可引起免疫反應，故在九十年代開始，已進行 人源性單抗的研制，尤其是絲狀噬菌體呈現技術的運用，使得人源性全套抗體庫的構 建獲得成功，避免了免疫動物等一系列繁瑣途徑.全套抗體庫的構建首先利用mRNA.直 接反轉錄成cDNA，構建成cDNA文庫，根據抗體可變區基因兩側序列的保守性，設計與 之結合的一對引物，以cDNA為模板，PCR擴增出抗體可變區重鏈和輕鏈基因，用接頭 DNA連接起來，再與絲狀噬菌體基因Ⅲ5'端重組，表達于噬菌體表面，然后將噬菌體 抗體文庫通過表面結合有特異性腫瘤抗原的親和柱，就可以篩選出相應的人源性單克 隆抗體.然后對單抗進行部分氨基酸序列分析，反推出數個寡核苷酸，以這幾個寡核 苷酸為引物，運用AP-PCR方法直接篩選出相應的抗原基因.

2.在骨腫瘤轉移機理研究中的應用

　　①nm23-H1基因與骨惡性腫瘤轉移相關性研究　nm23-H1基因是轉移抑制基因，它已在多種腫瘤中發現與轉移有關，但在骨腫瘤 中結果如何未見報道，作者擬對18例骨惡性腫瘤標本運用定量PCR儀，檢測了nm23-H1 表達程度.

　　引物P1為:5'GGGACGCAACTGTGAGCGTACCTTC3'；

　　引物P2為:5'GATTGGATCCTCATTCATAGATCCAGTTCTGACC3'

　　利用帶有熒光信號的通用接頭把熒光信號標記在P15'端，運用定量PCR儀，以正 常肝臟組織總RNA為模板，進行一系列倍比稀釋，運用RT-PCR一步法直接擴增.結果表 明，當模板為80ng時，25個循環后，擴增產物量與擴增指數呈線性關系，因此，當模 板采用80ng時，利用定量PCR儀可檢測出原始模板中nm23-H1拷貝數，從而可以判斷出 nm23-H1的表達程度.(研究表明，nm23-H1與骨惡性腫瘤轉移有關)同理，可以運用定 量PCR儀進行多種癌基因的檢測，從而篩選出與轉移相關的癌基因.

　　②骨腫瘤轉移基因的篩選研究　基因直選法是建立在分子雜交和PCR技術基礎上的一項基因分離技術，可以運用 于骨腫瘤轉移相關基因的篩選.基本原理是利用人的基因組區做誘餌，從骨腫瘤cDNA 文庫中釣出其互補區，然后進行PCR反應，使釣出的CDNA大量擴增，再將CDNA克隆進 行直接測序分析，然后用定量PCR方法檢測臨床轉移與非轉移標本，看表達相差的程 度，來進一步證實是否為骨腫瘤轉移相關基因.這種方法特別適用于正常情況下表達 很低的轉錄單位相應基因的分離.總之，PCR技術是一門非常有用的技術，掌握它可以 給基礎研究及臨床診斷帶來難以想象的收獲，尤其是PCR相關技術的發展給基礎研究 帶來了一場新的革命，PCR技術必將會獲得越來越廣泛的應用.

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