自1987年秋以來，PCR技術的應用開創性地推動了產前單基因缺陷者及攜帶者的 診斷。目前PCR還不能用于診斷所有已知缺陷疾病，但極大地擴大了實驗診斷學家對 診斷方法的選擇。JohnHopkins大學的研究人員表明，在診斷基因缺陷疾病方面PCR技 術具有快速、準確、操作靈活等特點。每項進展的實例在以后描述。在1987年10月 前，我們用Southern印跡法產前診斷鐮刀紅細胞貧血癥通常需要兩周或更長時間，而 1987年10月以后，應用PCR只需2-4天。在1987年以前，幾乎所有的β－地中海貧血癥 的產前診斷都是通過檢測在β－珠蛋白簇中連鎖DNA的多態間接完成的，一般需要2-4 周。1987年10月以后，用PCR擴增β－珠蛋白基因區后，直接檢測致病突變即可完成 β－地中海貧血癥的產前診斷。這個方法既增加了準確性，又縮短了時間，一般只需 一周時間。該項改進技術的作用，（1）如果我們不能確定在父母雙方中β－地中海 貧血的突變位置，我們還可以在1、2天之內研究β－珠蛋白基因簇中DNA的多態性； （2）通過比較母親與胎兒DNA序列差別來判斷母親傳染的程度。這只是說明PCR對基 因診斷意味著什么的幾個例子。以下我們舉幾個特例具體說明PCR技術的應用： 　　（1）通過擴增產物的打點雜交或限制性內切酶酶解方法確定已知的點突變； 　　（2）通過對擴增產物直接測序來發現已知或未知的突變； 　?。?）通過改變PCR擴增產物的大小或產物不能特異擴增來發現異常缺失； 　　（4）通過對DNA多態性研究來間接診斷致病突變。最后，還將討論PCR技術的技 術性難點、重要控制條件及局限性。

產前基因診斷基礎知識

　　產前基因診斷是逐步發展起來的，而且在不斷完善。1978年Kan和Dozy提出應用 與β－蛋白基因連鎖的DNA多態性來間接診斷鐮狀紅細胞貧血。此種診斷需要進行家 族性研究，以確定父母雙方的多態性等位基因類型，此等位基因型是用正常β－珠蛋 白基因及鐮狀紅胞β－珠蛋白基因探知的。家族被調查成員包括夫婦倆的孩子，如沒 有孩子，則調查夫婦雙方的父母。到1982年，通過利用MstⅡ限制性內切酶方法可以 直接產前診斷是否有鐮狀紅細胞貧血，因為內切酶MstⅡ及其同功酶Cv嗷螄xnNⅠ不能 在突變位點降解鐮狀β－珠蛋白基因而可在此位點降解正常βA－珠蛋白基因。這種 改進不需家族調查，就可更準確地進行鐮狀貧血病的產前診斷。正是這種改進法，使 直接而簡便地確定致病突變成為可能，這也是我們在所有基因診斷研究中所力求的。

　　單基因缺陷的診斷是通過對連鎖DNA多態性研究及家族研究而確定的。到1988年 底，我們利用這種方法診斷了一些患Duchenne肌營養不良癥病人、大多數甲型和乙型 血友病人、所有囊性纖維變性病人及Huntington氏病、神經性纖維瘤和成人多囊腎病 人。應用這種技術同時直接發現了鐮狀紅細胞貧血、β－地中海貧血、α地中海貧血 有大多數Duchenne肌營不良癥、部分甲型血友病和成視網膜細胞瘤病人的致病突變。 幾乎所有這些病例中，由于重要的DNA序列是已知的，所以PCR技術在產前診斷、癥發 前診斷及攜帶者發現等方面具有非常重要的價值。

應用PCR技術直接發現點突變

　　在點突變診斷中，繼PCR技術之后可用三種技術一打點雜交、酶切分析及直接測 序。John Hopkins大學研究人員應用以下幾步來診斷鐮狀紅細胞貧血：（1）將人絨 毛膜樣品（CVS）或羊水中得到的胚細胞在2MNaCl，0.1NNaOH溶液中煮沸。（2）應用 PCR技術在β珠蛋白基因5'末端擴增一個725bp區，用30個循環，72℃鏈延伸120''。 （3）用CvnI酶消化725bp擴增產物。（4）降解的產物進行電泳。（5）EB染色。（6） 紫外燈下觀察DNA片段，并拍照。

　　在反應中選擇使擴增產物含有兩固定CvnI位點的引物。因此，酶解產物至少應可 見三條帶。每個鐮狀紅細胞的β珠蛋白基因含有一個381bp帶，而正常βA珠蛋白基因 經酶結果已積累了大量信息，所以我們傾向選用限制性內切酶法消化經PCR擴增的產 物，而不是利用特異寡核苷酸探針經打點雜交來診斷βS突變位置的β突變位置。然 而，這種方法的的局限性（也是Southern雜交的局限性）是不能顯示包括第六密碼子 即βS突變位置的β珠蛋白基因的缺失。因此，一個雜合子個體（含一個βS珠蛋白基 因，及一個基因缺失）與患鐮刀狀紅細胞貧血病人（含兩個βs珠蛋白基因）酶切片 段的條帶圖形是一樣的。所以，在診斷這類病人時，會遇到一些困難，最后只有調查 其雙親才能確診。如果雙親都是βaβs基因型，這個人可確診為鐮狀紅細胞貧血癥。 如果雙親中一個一是βa型，另一個是βaβs基因型，此人診斷為βs雜合子基因型且 βs珠蛋白基因含一個缺失。由于突變引起的疾病具有一定特征，所以，理論上直接 確診β地中海貧血是可能的。發生地中海貧血癥的高危人群為地中海人、中東人、亞 州印度人、中國人和黑人。到1988年底，已知引起地中海貧血的突變有60多種，引起 地中海貧血的99％等位基因特征是已知的，其余的等位基因很少或存在于易患者很少 的種族中。因為每種人群有自己的β地中海貧血突變譜，一般情況下，4-6對等位基 因在任一特定種族的β地中海貧血基因中占99％以上，因此，使確定易患β地中海貧 血的夫婦二人的致病突變簡單化。

　　通常無子女的配偶雙方更應檢查，因為他們的紅細胞比積及血紅蛋白A2含量篩選 測試似乎具有β地中海貧血特征。其方法是檢查夫妻雙方是否含有所在人群中覺的等 位基因型。自1987年9月以來，在不利用DNA多態性和Southern分析方法情況下，在各 種簇中我們在產前明確診斷了80例地中海貧血病人，所有這些診斷是通過直接確定夫 婦及其胎兒的突變獲得的，此方法通常需要把打點雜交與限制性內切酶分析法結合起 來。需進行基因組序列分析的情況很少。60種地中海貧血的等位基因突變型的一半以 上類型可以通過擴增產物酶切分析方法查明。對于地中海地區的夫婦，通過這種方法 可以分析無意義密碼39，移碼6，IVS-2，nt-1，IVS-2，nt745，IVS-1，nt-6及-87。其 余在地中海人中常見的突變，IVS-1，nt110，IVS-1，ntl和移碼8全由打點雜交發現。

　　在打點雜交分析中，5-19％的擴增產物（通常為β珠蛋白基因從5'起的一半。片 段長度為725bp）在硝酸纖維膜上點兩次。對個體斑點通常是對照，以確定每個斑點 代表的是陽性結果，還是陰性結果。斑點與32p標記寡核苷酸（19mer或20mer）或非 同位素標記探針雜交，探針的序列對所研究的突變是特異性的。另一組同的斑點與正 常β珠蛋白基因序列雜交，以確定所定的DNA量足夠產生陽性信號。如果用突變探針 雜交結果為陰性而正常探針雜交結果為陽性，那么，我們可斷定病人沒有攜帶分析中 特寫的突變基因。如果兩種探針雜交結果均為陽性，病人為雜合人，病人攜帶有所研 究的突變基因；如果突變探針雜交顯示陽性結果，而正常探針雜交為陰性，病人為所 分析的突變基因純合子。

　　斑點表示ASO探針與用于β地中海貧血產前診斷的β珠蛋白DNA擴增產物的雜交 情況。利用ASO突變探針與擴增DNA雜交，表明雙親攜帶無意義密碼子39的突變。對 照樣品，一般用于洗滌特異性監測，它們點在從上數第3，第4點，分別代表正常β珠 蛋白純合子及無意密碼39β地中海貧血等位基因純合子DNA的擴增產物。上夫婦已有 孩子的DNA擴增產物只與突變的ASO雜交，而他們胎兒的擴增DNA既與突變ASO雜 交，也與正常ASO雜交，說明胎兒是β地中海貧血攜帶者。

　　在夫妻雙方的DNA均經過是否含有在其種族中普遍存在的突變等位基因型的檢查 后，極個別的情況下，夫婦中有一個人的β地中海貧血癥等位基因型仍是未知的。在 這點上，需對β珠蛋白基因上重要區段測序以確定未知的致病突變類型。用T7DNA聚 合酶（測序酶）在DNA基因組擴增區上測序。這些區域DNA包括（1）啟動子，外顯 子－1，內含子－1，外顯子2及內含子－2的5'端90個核苷酸；（2）內含子2的3'端300 個核苷酸和外顯子3。用此方法可以確定幾乎所有未知突變類型，但至少有兩個例 子，在輕度β是中海貧血癥等位基因攜帶者的β珠蛋白基因或5'和3'關鍵區中未找到 突變。在我們的工作中，通過對PCR擴增的β珠蛋白基因直接測序發現了7種新的等 位基因類型。Huisman在我們沒研究的其他種族中也發現了一些新的等位基因。

采用PCR技術發現缺失

　　利用缺失的5'和3'端引物可以檢測出中等大小片段的缺失（1-1.5bp），在印度 人群中，患β地中海貧血病人的β珠蛋白基因中通常存在一個619bp缺失片段。我們 發現在DNA中用引物可擴增產生1215bp片段，而當有619bp片段，可認為是缺失雜合 子。

　　缺失也可通過在PCR復合反應中沒有缺失基因的產物而其它基因產物仍然存在來 測出。Chehab等自先用此法證明了在α珠蛋白產物表明，純合缺失片段區至少有一個 α珠蛋白引物序列。最近，Chamberlain把這個方法用于患Duchenne肌營養不良（NMD） 的男性的營養不良基因的研究。DMD是一種X性連鎖嚴重的、早發肌營養不良癥，主要 原因是由于營養不良基因中缺失大約2000bp片段造成的。在肌營養不良基因中，大約 60-70％DMD等位基因發生大片段缺失。Chamberlain等已經測出重要區的DNA序列并制 備了對這些序列及其它已知序列特異的引物。他們找出了用9種引物對進行PCR反應， 以擴增營養不良基因所在的9個不同區段，在這些區段上有80-90％的缺失已知。用這 些引物對，確定了許多缺失（見第十五章），這些缺失由用營養不良cDNA探針進行的 Southern印跡法證實。這種用PCR復合反應進行缺失分析的方法可用于快速普查，并 可在50%的男性病人中發現突變。其作家族成員還需要進行cDNA探針分析以發現有無 其它缺失，以及用DNA多態性分析檢測家族內其他患者的情況。

　　在用復合PCR技術探測缺失方面也有兩個局限性。首先，無論何時當我們研究缺 失片段時會擔心擴增不出的片段實際上在基因組DNA上存在，只是由于其它未知的原 因而沒擴增出來。我們采用此方法，在我們實驗室曾遇到過，3個引物在某些正常樣 品中擴增出3種產物，而在其它的正常樣品中3個引物只擴增出2個產物。因此，在解 釋9個引物中有8個或7個引物有擴增產物的實驗結果時要非常謹慎。這意味著要進行 重復實驗才能確證基因缺失的存在。此外，在臨床應用復合PCR技術的早期，可采用 相應的營養不良cDNA探針進行Southern印跡法證實缺失片段。分析易患DMD的家族 時，分析攜帶者是重要的，目前可采用營養不良cDNA探針進行定量Southern印跡法來 診斷攜帶者。

應用PCR技術檢測連鎖性DNA多態性

　　在目的基因未被分離出來的情況下，在大多數產前診斷、攜帶者的發現及癥發前 診斷中所使用的基因診斷仍可完成。至1988年底，囊性纖維變性病、Huntington氏 病、神經纖維瘤等診斷就屬上述情況。這些病例的基因診斷完全依賴于用與疾病位點 連鎖的DNA多態性(RFLPs）對患者家族聽致病基因進行追蹤來完成。當重要DNA多態性 序列周圍的DNA序列已知時，應用PCR方法可以很簡便地知道重析內切酶位點的存在及 丟失。

　　Mullis和Faloona首先用DNA多態性PCR分析法診斷鐮狀紅細胞貧血，Kogan等用此 法診斷甲型血友病，但文獻表明應用PCR分析多態性位點周圍序列有潛在的局限性， 因多態性位點XbaI可以在同一基因組的其它部位復制。在短擴增片段及擴增Ⅷ：C因 子基因的目的區及第二區的引物上無其它XbaI位點。對帶有Ⅷ：C因子的男性DNA的 XbaI位點分析表明，除了多態性XbaI位點被切割產生的兩上小片段外，不被切割的片 段由第二區產生。具有＋／－多態性位點基因型的女性相區別。當應用Southern印跡 法時，就可以區分之，在Southern印跡法中，所分析的片段比從Ⅷ：C因子基因上復 制出的XbaI區大，此XbaI區大小與第二區不同

　　已報道過應用PCRDNA多態性分析法進行囊性纖維變性的產前診斷及Huntington氏 癥的癥發前診斷及產前診斷。另外，我們可以利用5個限制性內切酶多態性PCR法，對 β珠蛋白基因簇進行單體分類。如果直接法診斷β地中海貧血和鐮狀紅細胞貧血遇到 困難，可采用PCR分析家族成員單體型而間接、快速地進行產前診斷。因此，PCR被用 于許多單基因病變的臨床診斷，如鐮狀紅細胞貧血、地中海貧血、甲型血友病、 Duchenne肌營養不良癥、囊性纖維變性和Huntington氏癥。

技術難點

　　許多難點在開始已提到。既使其它引物能成功地擴增，一個引物對可能在同樣的 DNA模板上卻無法擴增。這就給應用復合PCR反應法準確地分析片段缺失帶來困難。

　　由于引物緩沖液被基因組DNA污染，可導致判斷上的失誤或極大的錯誤，因在用 被污染的引物所做的所有擴增樣品中可能會觀察到相同的結果。因此在取樣時應十分 謹慎，應把PCR所用的玻璃及塑料器皿與一般實驗所用的分開，偶爾，不知什么原因 造成某個基因組DNA的擴增失敗。常見的是因為在DNA提取過程中造成的污染。可通過 減少基因組解DNA樣品也造成擴增失敗，這時，需重新提取DNA。

展望

　　我們預期PCR將能用于普查攜帶者，尤其是下列一些疾病、在一個或多個種簇中 發病率很高的疾病、患者具有典型癥狀的疾病以及那些有關的基因已知的疾病和導致 所有突變等位基因的突變已知的疾病。應用DNA分析法來普查鐮狀紅細胞貧血β地中 海貧血攜者是可能的，但非DNA法仍比任何基因檢測都兼且簡便。應用PC技術在Ashk- enazi猶太人群中普查Tay-Sachs（家族黑蒙性白癡）等位基因攜帶者，具有很大可能 性。近來的研究表明在氨基已糖酶Aα鏈基因的兩個等位缺失可能是導致所有Ashken- azi人的Tay-Sachs病基因攜帶者進行普查。在北歐人群中，大約50％苯丙酮尿癥（PKU ）等位基因已被定性。除了現存基因分析，沒有其它方法可以檢出 PKU攜帶者。因有家族病史而非常有可能是攜帶者檢查，當PKU的等位基因完全清楚 后，這種檢查是可能的。

　　當找到CF（囊性纖維變性）基因及確定引起CF基因的等位突變特征后就可用PCR 技術普查攜帶者了。如果等位基因數目小（小于10）且沒有簡單的生化檢測法（以蛋 白缺失為原理）可以發現攜帶者類型時，利用基因技術普查攜帶者是可行的，利用 PCR技術普查人群中CF攜帶者來確定該病在人群中的發生率也是可行的。

　　利用PCR技術診斷單基因疾病的可能性極大，利用連鎖DNA多態性PCR診斷分析法 可對神經纖維瘤、成視網膜細胞瘤、成人多發性多囊腎癥及強直性肌營養不良進行診 斷。通過對各種致病基因經PCR擴增后用密度梯凝膠電泳進行外顯了序列分析，如甲 型血友病基因Ⅷ：C因子的外顯子，可直接對大多數患者進行突變等位基因的直接診 斷。一項新技術使基因診斷發生了重大改革，此技術是將帶有寡聚－T尾巴的寡核苷 酸固定在濾紙上，使其與生物素化的患者DNA目的區段的PCR產物雜交。此技術將簡化 一個個體基因組中5-10個或更多等位基因的分析，象現在的β地中海貧血癥等位基 因、鐮狀紅細胞貧血癥等位基因、PKU等位基因、CF等位基因及Tay-Sachs等位基因等 等。一個復合PCR反應可同時檢測一組基因。

　　在胚胎植入前進行遺傳特性分析因有PCR而成為可能。在分裂期從胚中取1-2個細 胞，用PCR可通過這些細胞的DNA進行基因診斷。此間胚可在體外繼續生長，然后植入 子宮。在其它種屬中，從分裂期胚中取少數細胞后再植入母體，胎兒的分化同樣正 常。因此在胚胎植入前進行基因診斷是可行的。但此方法的倫理問題是爭論的焦點， 且讓實驗檢查委員同意將在分裂期被取走少數細胞的人類胚進行植入是不可能的。

購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 www.adsraven.com