一、限制性內(nèi)切酶酶切注意事項

在進行限制性酶切反應(yīng)過程中,影響限制性酶切反應(yīng)效果的因素較多,要設(shè)計酶切反應(yīng),一般均應(yīng)考慮諸如酶切系統(tǒng)、溫度條件、反應(yīng)體積、底物性質(zhì)及星型反應(yīng)等因素。根據(jù)各種不同的條件,酶切反應(yīng)的設(shè)計一般應(yīng)注意以下問題：

1. 大多數(shù)限制酶貯存在50%甘油溶液中,以避免在-20℃條件下結(jié)冰。當(dāng)最終反應(yīng)液中甘油濃度大于12%時,某些限制酶的識別特異性降低,從而產(chǎn)生星活性,更高濃度的甘油會抑制酶活性。因此加入反應(yīng)的酶體積不超過反應(yīng)總體積的1/10,避免限制酶活性受到甘油的影響。

2. 濃縮的限制酶可在使用前用1×限制酶緩沖液稀釋,但切勿用水稀釋以免酶失活,用水稀釋的酶不能長期保存。

3. 反應(yīng)體系中Mg2+是限制酶僅有的共同因子,當(dāng)用其它二價陽離子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA時,酶活性會被抑制,或改變酶的特異性,導(dǎo)致星型反應(yīng)。

4. 多種因素可引發(fā)星型反應(yīng)：①非最適的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶濃度大于25u/ug；④鹽濃度降低；⑤高濃度甘油的存在(>12%)；⑥有機溶劑的存在。

5. 反應(yīng)混合物中DNA底物的濃度不宜太大,小體積中過高濃度的DNA會形成粘性DNA溶液抑制酶的擴散,并降低酶活性。建議酶切反應(yīng)的DNA濃度為0.1-0.4ug/ul。

6. 酶切反應(yīng)所加入的酶量應(yīng)適中,根據(jù)底物的種類、量的多少和體積的大小而定,對不同的限制酶,各廠家均有一最大的消化量指標(biāo)可參考。

7. 當(dāng)要用兩種或兩種以上限制酶切割DNA時,如果這些酶可以在同種緩沖液中作用良好,則兩種酶可同時切割,如果這些酶所要求的緩沖液有所不同,則可采用以下兩種替代方法：①先用在低離子強度的緩沖液中活性高的酶切割DNA,然后加入適量NaCl及第二種酶,繼續(xù)反應(yīng)；②使用能夠使多數(shù)內(nèi)切酶均表現(xiàn)較高活性的單種緩沖液。

8. 用同一種酶切割不同的DNA時,所需酶量不同,可根據(jù)DNA底物上酶切位點的多少與λDNA存在位點的數(shù)目比較后,決定用酶量。對于超螺旋DNA,基因組DNA、瓊脂糖包埋的DNA,使用的酶單位活性應(yīng)適當(dāng)加大。

9. 反應(yīng)混合液中加入濃度為0.1mg/ml的BSA,可維持酶的穩(wěn)定性。

10.酶切底物DNA應(yīng)具備一定的純度,其溶液中不能含有跡量酚、氯仿、乙醚,大于10mM的EDTA,去污劑SDS以及過量的鹽離子濃度,否則會不同程度地影響限制酶的活性。

11.DNA堿基上的甲基化修飾也是影響酶切的一個重要因素,所以轉(zhuǎn)化實驗所選擇的受體菌株應(yīng)考慮到使用的菌株中的酶修飾系統(tǒng)。

12.要保證酶作用時的最佳反應(yīng)條件(ph, 溫度)和底物用量,酶反應(yīng)才能有效地進行。

13.反應(yīng)取酶時應(yīng)使用無菌吸頭,以免污染酶液,同時應(yīng)盡量縮短酶在溫室的放置時間。

14.高于37℃或需長時間保溫時,可加入礦物油覆蓋在反應(yīng)液上以減少水分蒸發(fā)。

15.反應(yīng)混合物混勻時,應(yīng)避免強烈振蕩以保證不使內(nèi)切酶變性及DNA大分子的完整。

16.反應(yīng)前的低速離心是必要的,這可使因混勻吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。

17.用已硅化的離心管進行酶切反應(yīng),可獲得更佳的酶切效果,否則DNA可能粘附于管壁而影響酶切效果。

18.終止酶反應(yīng)可根據(jù)需要采用不同的方法：①酶切后不需進行下一步反應(yīng),可加入含EDTA的終止液終止反應(yīng)；②若需進一步反應(yīng)(如連接,切割等),可將反應(yīng)管置65℃保溫20-30分鐘,以滅活酶終止反應(yīng)。③可用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀獲得較純DNA進行下一步酶學(xué)操作。

19. 不同廠家的試劑不可混用,需要時請查明相關(guān)條件及數(shù)據(jù)。

二、限制性酶解中常見的問題及解決措施

限制性酶切割DNA底物的操作過程中,會出現(xiàn)一些問題,產(chǎn)生的原因主要為酶解體系中各要素處于非最佳狀態(tài),包括DNA的純度和特性,反應(yīng)緩沖液、反應(yīng)體積、反應(yīng)時間及溫度等。

問題 原因 解決辦法

 DNA完全沒有被內(nèi)切酶切割 1) 內(nèi)切酶失活 標(biāo)準(zhǔn)底物檢測酶活性 2) DNA不純,含有SDS,酚,EDTA等內(nèi)切酶抑制因子 將DNA過柱純化,乙醇沉淀DNA 3) 條件不適(試劑、溫度) 檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳 4) DNA酶切位點上的堿基被甲基化 換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解,重新將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至dcm-,dam-基因型的細(xì)菌菌株 5) DNA酶切位點上沒有甲基化(如Dpn I) 換用不同切割非甲基化位點的同裂酶消化DNA(如San3A I代替Dpn I),重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+ dam+菌株中擴增 6) DNA位點上存在其它修飾 將DNA底物與λDAN混勻進行切割驗證 7) DNA不存在該酶識別順序 換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進行驗證

DNA切割不完全 1) 內(nèi)切酶活性下降 用5-10倍量過量消化 2) 內(nèi)切酶稀釋不正確 用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶 3) DNA不純,反應(yīng)條件不佳 同上 4) 內(nèi)切酶識別的DNA位點上的堿基被甲基化或存在其它修飾 同上 5) 部分DNA溶液粘在管壁上 反應(yīng)前離心數(shù)秒 6) 內(nèi)切酶溶液粘度大,取樣不準(zhǔn) 將內(nèi)切酶稀釋,增大取樣體積 7) 酶切后DNA粘末端退火 電泳前將樣品置65℃保溫5-10分鐘,取出后置冰浴驟冷 8) 由于反應(yīng)溶液、溫度、強烈振蕩使內(nèi)切酶變性 使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液及溫度,避免強烈振蕩 9) 過度稀釋使酶活性降低 適當(dāng)稀釋酶液,反應(yīng)液稀釋的酶不能貯藏 10)反應(yīng)條件不適 使用最佳反應(yīng)體系 11)識別位點兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序 加大酶量5-10倍

DNA片段數(shù)目多于理倫值 1) 內(nèi)切酶星狀活性 檢查反應(yīng)條件：甘油濃度大于12%,鹽度過低,Mn2+的存在及酶：DNA值過大均均可導(dǎo)致星狀活性,降低酶的用量 2) 其它內(nèi)切酶污染 用λDNA作底物檢查酶切結(jié)果 3) 底物中含其它DNA雜質(zhì) 電泳檢查DNA,換用其它酶切,純化DNA片段 酶切后沒有觀察到DNA片段的存在 1) DNA定量錯誤(如RNA含量較高) 用RNA酶A(無DNA酶)100ug/ml消化DNA樣,酚抽提后沉淀溶解,定量 2) 在酶切反應(yīng)液中形成非特異的沉淀 在反應(yīng)前透析DNA樣品或用酒精沉淀二次

內(nèi)切酶保存期內(nèi)快速失活 1) 保存溫度不合適 內(nèi)切酶貯藏在含50%甘油的貯藏液中,應(yīng)在-20℃低溫保存 2) 以稀釋形式保存 稀釋酶液不宜長期存放,應(yīng)一次使用 3) 貯藏緩沖液不適當(dāng) 使用廠家推薦的貯藏緩沖液 4) 低蛋白濃度 內(nèi)切酶與500ug/ml的BSA一起保存 電泳后DNA片段的帶型彌散,不均一 1) DNA上結(jié)合有蛋白質(zhì) 電泳前上樣液65℃加熱5min,并加入0.1%的SDS,酚/氯仿抽提純化 2) 內(nèi)切酶中含有DNA外切酶 減少酶用量或消化時間,換用新包裝的酶

酶切后的DNA片段連接效率低 1) 含磷酸鹽的濃度高 透析,乙醇沉淀去除磷酸鹽 2) 內(nèi)切酶失活不全或含有ATP酶 延長滅活時間或用酚抽提,乙醇沉淀回收DNA 3) 平末端連接 加大T4 DNA Ligase用量 4) 外切酶污染 減少酶用量,縮短保溫時間,酚抽提回收DNA 5) 連接緩沖液不合適 重新配制連接緩沖液

三、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)問題分析

問題 原因 解決辦法

帶弱或無DNA帶 1) 上樣DNA的量不夠 增加DNA的上樣量,聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高 2) DNA降解 避免DNA的核酸酶污染 3) DNA走出凝膠 減短電泳時間,降低電壓,增強凝膠濃度 4) 對于EB染色的DNA,所用紫外光源不合適 應(yīng)用短波長(254nm),紫外燈增強靈敏度

DNA帶缺失 1) 小DNA帶走出凝膠 減短電泳時間,降低電壓,增強凝膠濃度 2) 分子大小相近的DNA帶不易分辨 增加電泳時間,核準(zhǔn)正確的凝膠濃度 3) DNA 變性 電泳前請勿高溫加熱DNA鏈,以20mM NaCl Buffer稀釋DNA 4) 巨大DNA鏈,凝膠電泳不合適 在脈沖電聲凝膠電泳上分析

 DNA帶模糊 1) DNA降解 避免核酸酶污染 2) DNA上樣量過多 減少凝膠中DNA上樣量 3) 所用電泳條件不合適 電泳時電壓不應(yīng)超過20V/cm,溫度<30℃,巨大DNA鏈,溫度應(yīng)<15℃,核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力 4) DNA樣含鹽過高 電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽 5) 有蛋白污染 電泳前酚抽提去除蛋白 6) DNA變性 電泳前勿加熱,用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA

不規(guī)則DNA帶遷移 1) 對于λ/Hind III片段COS位點復(fù)性 電泳前加熱DNA 65℃加熱5-10分鐘,然后在冰上冷卻5分鐘 2) 電泳條件不合適 電泳電壓不超過20V/cm,溫度<30℃,電泳緩沖液有足夠的緩沖能力 3) DNA變性 以20mM NaCl Buffer稀釋DNA,電泳前勿加熱 以λ/Hind III為代表的λDNA酶切片段用作電泳分析中的分子量標(biāo)準(zhǔn),會發(fā)現(xiàn)電泳后分子量條帶不對的問題,解釋原因如下：在Lambda DNA分子的左右臂存在著12個堿基組成的具有互補順序的單鏈突出端-COS位點,COS位點的退火復(fù)性,在λDNA片段電泳分離時會出現(xiàn)問題,含左右臂片段在膠上應(yīng)出現(xiàn)的地方條帶會減弱或完全看不到,而復(fù)性的左右臂片段會結(jié)合成大的片段,即在較大的分子量區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生一個額外的條帶,這就造成了不正常的帶型。解決以上問題的辦法,是在電泳之前,把DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)67℃加熱約10分鐘,然后立即放入冰浴中驟冷,待樣品冷卻后上樣。這樣即可解離復(fù)性的粘性末端,使電泳過程DNA片段形成正常的帶型分布。

四、凝膠電泳操作注意事項

1. 緩沖系統(tǒng)：在沒有離子存在時,電導(dǎo)率最小,DNA不遷移,或遷移極慢,在高離子強度的緩沖液中,電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱,可能導(dǎo)致DNA變性,因此應(yīng)注意緩沖液的使用是否正確。長時間高壓電泳時,常更新緩沖液或在兩槽間進行緩沖液的循環(huán)是可取的。

2. 瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖,其雜質(zhì)含量不同,影響DNA的遷移及熒光背景的強度,應(yīng)有選擇地使用。

3. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致,溶解的凝膠應(yīng)及時倒入板中,避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡,影響電泳結(jié)果。

4. 樣品加入量：一般情況下,0.5cm寬的梳子可加0.5ug的DNA量,加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定,過多的量會造成加樣孔超載,從而導(dǎo)致拖尾和彌散,對于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。

5. 電泳系統(tǒng)的變化會影響DNA的遷移,加入DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物進行判定是必要的。

6. DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率,平行對照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。

7. DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度,遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子,制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段的DNA電泳應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率。

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