康寧/Corning® 淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基

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1、細(xì)胞（組織）培養(yǎng)年鑒

1878 Claude Bernard:證明一個(gè)器官的生理系統(tǒng)在個(gè)體死亡以后仍然可以人工維持。

1885 Wilhelm Roux:在一個(gè)生理溶液中維持一快雞胚的活性并觀察其發(fā)育，從而證實(shí)該發(fā)育與雞胚的其他部分無關(guān)。

1887 Ross Harrison:利用凝固的青蛙淋巴液作為培養(yǎng)基，在體外培養(yǎng)青蛙神經(jīng)嵴，維持其活性達(dá)數(shù)星期，并觀察到了神經(jīng)纖維的生長，從解決了神經(jīng)纖維的來源問題。Ross Harrison被人稱為細(xì)胞培養(yǎng)之父。

1910 Burrows:率先在血漿凝塊中長期培養(yǎng)雞胚細(xì)胞.

1911 Lewis & Lewis:由海水、血清、胚胎提取物和鹽和蛋白胨為原料配制成了第一個(gè)人工的細(xì)胞培養(yǎng)液，并觀察到了單層細(xì)胞的有限生長。

1916 Rous & Jones:開創(chuàng)使用胰酶來收獲貼壁生長的細(xì)胞。

1923-1931 Carrel & Baker:研制T型培養(yǎng)瓶大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞。

1927 Carrel & Rivera:制造了第一個(gè)病毒疫苗：牛痘疫苗。

1933 Gey: 發(fā)明了轉(zhuǎn)管培養(yǎng)細(xì)胞的技術(shù)。

1948 Fisher: 研制成了第一個(gè)化學(xué)成分清楚的細(xì)胞培養(yǎng)液CMRL1006，該培養(yǎng)液至今還在使用。

1952 Gey 和同事：分離培養(yǎng)了Hela細(xì)胞。

1952 Dulbecco:發(fā)明了噬斑法，用長滿的單層細(xì)胞檢測病毒。

1954 Abercrombie: 觀察到了體外培養(yǎng)細(xì)胞接觸抑制的現(xiàn)象。

1961 Hatflick & Moorhead：顯示人成纖維細(xì)胞在一定的代數(shù)之后會死亡。

1965 Ham:配制了第一個(gè)無血清培養(yǎng)液。

1975 Kohler & Miltein:成功的得到了第一個(gè)用于單抗生產(chǎn)的雜交瘤細(xì)胞株。

2、怎樣查到一個(gè)特定細(xì)胞株的相關(guān)知識和培養(yǎng)條件？

ATCC (American Type Culture Collection) 收集了絕大多數(shù)常用細(xì)胞的詳細(xì)資料。

打開ATCC網(wǎng)頁的Cells and hybridomas鏈接，輸入細(xì)胞名稱就可以搜索ATCC的細(xì)胞數(shù)據(jù)庫。

數(shù)據(jù)庫中有每一種細(xì)胞的詳細(xì)描述，包括細(xì)胞的來源，培養(yǎng)和凍存條件，顯微形態(tài)以及相關(guān)文獻(xiàn)等資料。

3、為什么大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)需要用二氧化碳培養(yǎng)箱?

一般細(xì)胞培養(yǎng)液的pH在7.0-7.4之間。由于碳酸鹽pH緩沖系統(tǒng)是一種生理pH緩沖系統(tǒng)（它是人體血液中最重要的pH緩沖系統(tǒng)），所以大多數(shù)培養(yǎng)液用它來保持穩(wěn)定的pH。用粉末配制培養(yǎng)液時(shí)，常常需要加入一定量的碳酸氫鈉。

對大多數(shù)以碳酸鹽作為pH緩沖系統(tǒng)的培養(yǎng)液而言，以為了維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)箱中的二氧化碳需要維持在2-10%之間，以保持培養(yǎng)液中溶解的二氧化碳的濃度。同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)的器皿需要一定程度的透氣，以便于氣體的交換。

是不是采用其他pH緩沖系統(tǒng)就不需要二氧化碳培養(yǎng)箱了呢？人們發(fā)現(xiàn)由于空氣中的二氧化碳濃度很低，如果細(xì)胞不在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中的HCO3-會被耗盡，這樣會影響細(xì)胞的正常生長。所以大部分動物細(xì)胞的培養(yǎng)，還是需要二氧化碳培養(yǎng)箱。

細(xì)胞培養(yǎng)液中常附加其他的pH緩沖系統(tǒng)，比如HEPES緩沖系統(tǒng)，來增加pH緩沖能力。HEPES在pH7.2-7.4之間有很強(qiáng)的緩沖能力，當(dāng)透氣的培養(yǎng)器皿被拿到二氧化碳培養(yǎng)箱外面的時(shí)候，由于空氣中二氧化碳濃度很低，培養(yǎng)液中碳酸鹽緩沖系統(tǒng)就會失去效果，這時(shí)候HEPES緩沖系統(tǒng)就能繼續(xù)保持pH的穩(wěn)定。

4、二氧化碳培養(yǎng)箱的挑選和使用

由于動物細(xì)胞培養(yǎng)液一般使用碳酸鹽pH緩沖系統(tǒng)，要求培養(yǎng)環(huán)境中維持一定濃度的CO2，所以動物細(xì)胞的培養(yǎng)一般需要CO2培養(yǎng)箱。

CO2培養(yǎng)箱采用兩種不同的CO2維持系統(tǒng)。一種方式是通過使用空氣泵，將CO2和空氣按一定比例混合后吹入培養(yǎng)箱。另一種方式是通過一個(gè)自動的CO2檢測控制系統(tǒng)，在檢測到CO2濃度低于要求濃度時(shí)打開CO2氣閥充入CO2。由于前一種方法耗費(fèi)CO2而且不容易精確控制CO2濃度，先進(jìn)的CO2培養(yǎng)箱都采用自動監(jiān)控系統(tǒng)來維持CO2的濃度。

配有自動CO2檢測控制系統(tǒng)的培養(yǎng)箱需要根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明，定期做CO2濃度的測試和矯正，防止因?yàn)榱泓c(diǎn)漂移而導(dǎo)致CO2顯示濃度和實(shí)際濃度不一致。

CO2培養(yǎng)箱的隔熱采用水套式和氣套式兩種類型。水套式需要用戶在安裝培養(yǎng)箱時(shí)培養(yǎng)箱壁的空間內(nèi)灌入大量蒸餾水。由于水的比熱容很高，水套式的優(yōu)點(diǎn)是有助于均勻散熱和避免形成冷區(qū)，以及在斷電后能夠比較好的減緩培養(yǎng)箱內(nèi)溫度的降低。它的缺點(diǎn)是由于灌入大量的水，培養(yǎng)箱變得非常沉重，不易搬動。有效的隔熱系統(tǒng)和先進(jìn)的表面散熱元件的使用使氣套式培養(yǎng)箱兼?zhèn)淞溯p便性和水套式培養(yǎng)箱的優(yōu)點(diǎn)，所以新型的CO2培養(yǎng)箱大多采用氣套式。

目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都使用進(jìn)口的細(xì)胞培養(yǎng)箱。雖然進(jìn)口的產(chǎn)品質(zhì)量上比較有保障，但價(jià)格很貴，而且售后服務(wù)不是很方便。國內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)箱的質(zhì)量也有了很大的提高，價(jià)格低，售后服務(wù)也比較方便（筆者目前使用的二氧化碳培養(yǎng)箱是長沙長錦科技的，質(zhì)量和售后服務(wù)都不錯(cuò)）。

CO2培養(yǎng)箱一般配一個(gè)水盤，用以維持很高的濕度。水盤內(nèi)的水要定期添加，水盤也要定期清洗以避免微生物的生長。

為了減少微生物的污染，有一些CO2培養(yǎng)箱提供滅菌功能。有的可以加熱到比較高的溫度來滅菌，有的則通過讓空氣循環(huán)通過一個(gè)紫外線腔體的辦法來滅菌，這樣就滅菌時(shí)就不需要中斷細(xì)胞的培養(yǎng)。

5、超凈臺的挑選和使用

為了避免污染，一般的細(xì)胞培養(yǎng)需要在超凈臺上進(jìn)行。用于細(xì)胞培養(yǎng)的超凈臺的潔凈度一般為100級，即每立方英尺中大于0.5um的顆粒數(shù)量少于100顆，與計(jì)算機(jī)硬盤的生產(chǎn)環(huán)境要求相當(dāng)。

在超凈臺內(nèi)，過濾后的空氣垂直由上到下，或水平由內(nèi)到外穩(wěn)定的流動，從而維持一個(gè)潔凈的操作環(huán)境。根據(jù)氣流的方向，超凈臺可分為垂直式層流和水平式層流兩種類型。

在水平式層流型超凈臺內(nèi)，過濾后的空氣由內(nèi)到外流動，在操作過程中比垂直式層流型更容易維持一個(gè)潔凈的環(huán)境，減少污染的機(jī)會。但是由于氣流吹向?qū)嶒?yàn)操作者，增加了實(shí)驗(yàn)操作者感染病原體的機(jī)會，所以大部分實(shí)驗(yàn)室都采用垂直式層流型的超凈臺。

在普通的垂直式層流型的超凈臺內(nèi)，過濾后的空氣自上往下流動，通過操作面板前后兩排開孔直接排出。這樣的超凈臺比較便宜，但是不適合病原體相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作。相關(guān)病原體的操作必須要在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。在生物安全柜內(nèi)，自上而下的過濾后的空氣經(jīng)過超凈臺，然后再次過濾后，才被排到外面，從而大大減少了病原體擴(kuò)散的機(jī)會。當(dāng)然生物安全柜比較貴，但考慮到培養(yǎng)的細(xì)胞中以及血清中都有可能有病毒等病原體的存在，有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該盡量使用生物安全柜來進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

超凈臺需要定期檢查，超凈臺的空氣過濾系統(tǒng)也需要定期更換，以保證超凈臺內(nèi)的潔凈度。空氣過濾系統(tǒng)的更換次數(shù)可以詢問生產(chǎn)廠家。如果有潔凈度檢測設(shè)備的話，可以非常迅速的檢驗(yàn)超凈臺的潔凈度。如果懷疑細(xì)胞培養(yǎng)過程中的污染是由于超凈臺內(nèi)潔凈度降低引起的，可以用將一個(gè)含微生物培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿在超凈臺內(nèi)敞口放置一段時(shí)間，然后在37℃培養(yǎng)的方法來評估。

超凈臺內(nèi)一般都有紫外線燈用于滅菌。紫外線燈的正確使用方法是在超凈臺使用前打開半小時(shí)左右。有的操作人員在不使用超凈臺的時(shí)候把紫外線燈一直打開，這樣不但沒有必要，而且會大大縮短紫外線燈的使用壽命。紫外線燈要根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明定期更換。

超凈臺使用完之后要先用蒸餾水擦拭，然后再用70%酒精擦拭。直接用70%酒精擦拭濺在臺面上的培養(yǎng)液會在不銹鋼臺面上留下難以去除的污漬。

6、為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時(shí)傳代？

體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有生長接觸抑制的特性，也就是說當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時(shí)候，它就會停止生長。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)器皿的表面時(shí)，正常的細(xì)胞停止生長，但是轉(zhuǎn)化（即發(fā)生遺傳物質(zhì)突變）的對接觸抑制不敏感的細(xì)胞會繼續(xù)生長。如果不及時(shí)傳代，這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞就會逐步取代正常的細(xì)胞。

7、細(xì)胞培養(yǎng)中流行的錯(cuò)誤（過時(shí)）知識

（1）血清一定需要加熱滅活

人們通常通過在56°C加熱30分鐘的辦法，來滅活血清中的補(bǔ)體，以及其中可能的微生物（比如支原體）的污染。加熱滅活帶來的問題是，血清中的氨基酸、維生素和生長因子等也會不同程度的被破壞。

Triglia and Linscott 的研究發(fā)現(xiàn)（1），胎牛血清中的補(bǔ)體含量很低，即使在未稀釋的胎牛血清中，也觀察不到溶血現(xiàn)象。另外37°C的加熱能夠有效滅活補(bǔ)體。所以對胎牛血清而言，并不需要通過專門的熱滅活來滅活其中的補(bǔ)體。

早期的血清制備中的濾膜的孔徑大于0.22um，不能有效的去除支原體的污染。熱滅活可以去除支原體的污染。但是現(xiàn)在血清制備中的終端濾膜的孔徑為0.1um甚至小到0.04um，所以血清中一般沒有支原體的污染。

綜合上面的觀點(diǎn)，除非有特別的情況，標(biāo)準(zhǔn)廠家生產(chǎn)的胎牛血清一般不需要加熱滅活。

需要說明的是，有些廠家生產(chǎn)的胎牛血清質(zhì)量并不符合標(biāo)準(zhǔn)。所以如果您的胎牛血清來自一家可信度不高的廠家，那么為了安全起見，還是以加熱滅活為好。

（2）培養(yǎng)液中一定要加抗生素

隨著超凈臺技術(shù)的提高，和超凈臺在細(xì)胞培養(yǎng)中的廣泛使用，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中如果操作規(guī)范，引進(jìn)污染的機(jī)會并不大。同時(shí)抗生素的使用大大增加了支原體等微生物污染的機(jī)會，所以普通的細(xì)胞培養(yǎng)，最好不要加抗生素。

（3）細(xì)胞培養(yǎng)室要異常的潔凈

由于以前超凈臺技術(shù)比較差，在超凈臺開啟的時(shí)候，外面的灰塵可能飄到超凈臺里，筆者曾經(jīng)見過的一個(gè)老式的沒有空氣過濾裝置超凈臺，僅使用紫外線燈滅菌，這樣實(shí)驗(yàn)室的清潔就顯得很重要。現(xiàn)代的超凈臺從原理上來說，超凈臺外的污染源是很難到達(dá)超凈臺里面的(見文章5：超凈臺的挑選和使用)。所以保持細(xì)胞培養(yǎng)室一定程度的清潔固然有助于減少污染的機(jī)會，但是過度的清潔，比如用0.2%新潔爾滅拖地板，或者在培養(yǎng)室內(nèi)加紫外線燈消毒，并不需要，更重要的是實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范。筆者曾經(jīng)工作過的一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室，維護(hù)實(shí)驗(yàn)室清潔的工作就是每天拖一次地板，每天大家進(jìn)出并不換鞋換衣服，在2年多的時(shí)間內(nèi)從沒有發(fā)生過任何污染。

（4）在超凈臺上使用酒精燈

事實(shí)上使用酒精燈會造成空氣對流，從而帶起超凈臺面上的灰塵，反而增加污染的機(jī)會。更何況還增加了火災(zāi)的隱患。

[1]Triglia, R.P., Linscott, W.D. 1980. Titers of nine complement components, conglutinin and C3b inactivator in adult and fetal bovine sera. Molecular Immunology. 17:741-748.

8、一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿等標(biāo)明 “Tissue Culture Treated”是什么意思？

大部分動物細(xì)胞需要貼附在一個(gè)固相界面上才能生長。而一般只有親水的固相界面，細(xì)胞才能貼附。

最早的細(xì)胞培養(yǎng)器皿是由玻璃制作的。由于玻璃的表面是親水的，不經(jīng)過特殊的處理，普通的細(xì)胞就可以貼附生長。

聚苯乙烯透光性能好，具有較好的強(qiáng)度和易塑性，并且沒有毒性，成為一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等一次性細(xì)胞培養(yǎng)耗材的首選材料（一般的磁帶和CD盒也是用聚苯乙烯制成的）。然而聚苯乙烯表面是憎水的，所以需要經(jīng)過表面的改性處理，變成親水后才能適用于細(xì)胞培養(yǎng)。

一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿等標(biāo)明“Tissue culture treated”，是表示該器皿經(jīng)過表面的改性處理，適合貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。而懸浮生長的細(xì)胞，就不一定需要這樣經(jīng)過特殊處理過的器皿。 但經(jīng)過表面的改性處理后的細(xì)胞培養(yǎng)皿等一般也適合懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。

9、細(xì)胞培養(yǎng)中邊緣效應(yīng)和解決辦法

在使用多孔板的細(xì)胞培養(yǎng)中，周邊孔的細(xì)胞生長情況和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)常常和其他孔有系統(tǒng)誤差，這種現(xiàn)象統(tǒng)稱為邊緣效應(yīng)。在很多大規(guī)模藥物篩選實(shí)驗(yàn)中，人們甚至棄去周圍孔，不用于實(shí)驗(yàn)。

引起邊緣效應(yīng)的原因有多種，其中最常見的也容易明白的是周邊孔水份揮發(fā)比其他孔多而導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差，這在四個(gè)角上的孔中尤其明顯。對于這個(gè)問題目前沒有根本的解決辦法。不過可以采用少開培養(yǎng)箱從而保持培養(yǎng)箱中的濕度等辦法來減輕。

另外一個(gè)不容易解釋的邊緣效應(yīng)是，在周邊孔中的細(xì)胞會集中在孔的外側(cè)，如下圖所示（孔內(nèi)白亮的為細(xì)胞集中的區(qū)域）。這種現(xiàn)象在實(shí)驗(yàn)中常用的96孔板中十分明顯。由于大多細(xì)胞的生長會受周圍接觸細(xì)胞的抑制，所以這種邊緣效應(yīng)導(dǎo)致邊緣孔內(nèi)細(xì)胞平均生長速度要比其他孔來得慢，從而在實(shí)驗(yàn)過程中引入系統(tǒng)誤差。這種邊緣效應(yīng)是由于在室溫下的培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱后，培養(yǎng)板上產(chǎn)生的溫度差影響細(xì)胞沉降引起的。所以這種解決邊緣效應(yīng)的一個(gè)簡單有效的方法，就是在培養(yǎng)板內(nèi)分入細(xì)胞后，在室溫下放置1-2個(gè)小時(shí)，讓細(xì)胞在沒有溫度差的情況下沉降并貼附，然后再轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱內(nèi)[1]。該方法至少適合CHO等在室溫下能貼壁的細(xì)胞。

[1]BETINA KERSTIN LUNDHOLT, KURT M. SCUDDER, and LEN PAGLIARO, A Simple Technique for Reducing Edge Effect in Cell-Based Assays. Journal of Biomolecular Screening 2003:566-570

10、細(xì)胞培養(yǎng)液簡介

雖然細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)早在19世紀(jì)末就開始了，但用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液主要是動物的血清或淋巴液。被人稱為細(xì)胞培養(yǎng)之父的Ross Harrison就是利用青蛙的淋巴液來培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的。這樣的培養(yǎng)液不但性質(zhì)不穩(wěn)定，而且只能進(jìn)行非常小規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)。

第一個(gè)人工配制的培養(yǎng)液是由Lewis & Lewis在1911年由海水、血清、胚胎提取物和鹽和蛋白胨為原料配制成的。但是人們對于培養(yǎng)液中的化學(xué)成分并不清楚。直到1948年，F(xiàn)isher才研制成了第一個(gè)化學(xué)成分清楚的細(xì)胞培養(yǎng)液CMRL1006。

實(shí)驗(yàn)室常用的細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是氨基酸、葡萄糖、無機(jī)鹽、維生素和微量元素等。為了維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)液中一般有一個(gè)pH緩沖系統(tǒng)，同時(shí)常加入少量的酚紅作為pH指示劑。另外培養(yǎng)液中一般需要加入一定量的血清。

培養(yǎng)液中的氨基酸除了13種細(xì)胞生長所必須的氨基酸外，往往加入一些非必需的氨基酸以促進(jìn)細(xì)胞的生長。在必需的氨基酸中，L-谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定（在4℃培養(yǎng)溶液中半衰期為3個(gè)星期，37℃中為1個(gè)星期），需要在使用時(shí)加入。

葡萄糖在培養(yǎng)液中的含量一般為1g/L（低糖）或4.5g/L（高糖）。它是細(xì)胞代謝重要的能量來源。

細(xì)胞培養(yǎng)液中都有一個(gè)平衡鹽系統(tǒng)，用于維持細(xì)胞的滲透壓、維持pH和細(xì)胞正常的代謝等。最常用的平衡鹽系統(tǒng)有Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS); Earle's balanced salts (EBSS) 和 Hanks' balanced salts (HBSS)。它們都含有細(xì)胞所必需的5種離子：鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子和磷酸根。培養(yǎng)液中的pH緩沖系統(tǒng)一般是碳酸氫鈉和HEPES等。

培養(yǎng)液中的維生素包括葉酸、維生素B、煙酰胺和吡哆醇等。培養(yǎng)液中的微量元素元素包括Cu2+ ，Zn2+ ，和Mn2+等。

血清中含有生長因子、促進(jìn)細(xì)胞帖壁的因子、礦物質(zhì)、激素、脂類等，另外血清可以抑制胰酶的活性。

一般培養(yǎng)液都含酚紅作為pH指示劑，它是細(xì)胞培養(yǎng)液狀態(tài)的一個(gè)很好的標(biāo)志。過長時(shí)間的培養(yǎng)或者微生物的污染都會使培養(yǎng)液的pH發(fā)生改變。需要注意的是，酚紅可以模擬類固醇激素（尤其是雌性激素）的作用，所以如果培養(yǎng)的細(xì)胞對雌性激素敏感（比如實(shí)驗(yàn)本身就是研究雌性激素對細(xì)胞的作用），就應(yīng)當(dāng)使用沒有酚紅的培養(yǎng)液。

11、選用血清時(shí)要注意什么？

細(xì)胞培養(yǎng)使用的一般是胎牛血清。由于胎牛血清價(jià)格非常貴，為了節(jié)約，對于一些比較容易生長的細(xì)胞，有時(shí)候也使用新生牛血清，或者馬血清。

血清中含有血清清蛋白、生長因子等。對于大多數(shù)培養(yǎng)的動物細(xì)胞而言，培養(yǎng)液中加入血清是生長必須的。雖然無血清培養(yǎng)液已經(jīng)出現(xiàn)，但無血清培養(yǎng)液只適用于特定的細(xì)胞，而且價(jià)格一般比較昂貴，所以在比較長的時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)仍然需要血清。

對于一種特定的細(xì)胞，可以從ATCC（American Type Culture Collection）查到培養(yǎng)液中需要加入的血清的種類和濃度。

來自不同商家的血清差異很大，即使來自同一商家的血清，不同批次之間仍然會有非常大的差異。對于培養(yǎng)不易生長的細(xì)胞而言，挑選優(yōu)質(zhì)的血清非常重要。一般來說，可以向血清生產(chǎn)商家索取少量不同批次的血清，經(jīng)過試驗(yàn)后找到對細(xì)胞生長最有利的批次，然后大量購買該批次的血清，儲存于-80度的冰箱內(nèi)，供長期使用。

12、細(xì)胞培養(yǎng)過程中有哪些污染？

細(xì)胞培養(yǎng)中的污染分為兩類，化學(xué)污染和生物污染。

化學(xué)污染

化學(xué)污染是一些對細(xì)胞有毒性的或?qū)?xì)胞產(chǎn)生刺激的化學(xué)物質(zhì)。這些污染一般來自于沒有洗凈的器皿、不純的化學(xué)試劑和質(zhì)量較差的蒸餾水等。

化學(xué)污染中比較引人注意的是細(xì)菌內(nèi)毒素。它是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞死亡后解體釋放出的疏水性的細(xì)胞壁組成物質(zhì)，對塑料等疏水性強(qiáng)的物質(zhì)有很強(qiáng)的吸附能力。細(xì)菌內(nèi)毒素可刺激部分細(xì)胞產(chǎn)生一些激素或細(xì)胞因子，對細(xì)胞生長和實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。細(xì)菌內(nèi)毒素是臨床上的最主要的熱原（即注射到動物體內(nèi)會導(dǎo)致動物發(fā)熱），所以通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的疫苗、細(xì)胞因子等用在臨床上的藥品的生產(chǎn)過程中更是要避免細(xì)菌內(nèi)毒素的污染。

生物污染

生物污染包括比較容易發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌、霉菌和酵母的污染，和較難發(fā)現(xiàn)的病毒、支原體和其他細(xì)胞的污染。

細(xì)菌、霉菌和酵母到處存在，它們能在合適的環(huán)境中非常快速的生長。這些污染比較容易觀察到，它們往往會使其污染的培養(yǎng)液產(chǎn)生可見的變化，或者通過顯微鏡觀察就可以看見。

由于病毒有種屬特異性，所以病毒污染的概率比較小。但是病毒污染難于發(fā)現(xiàn)，因?yàn)椴《绢w粒特別微小，一般的實(shí)驗(yàn)室都沒能力檢查細(xì)胞培養(yǎng)中污染的病毒。由于病毒一般潛伏在細(xì)胞內(nèi)，對整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)不是致死的，所以它可能會使研究人員長期得到受病毒影響的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1956 年 Robinson 及其同事首次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染。90年代初的一個(gè)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在美國培養(yǎng)的細(xì)胞中，至少有15%被支原體污染 。由于支原體沒有細(xì)胞壁，在細(xì)胞培養(yǎng)液中幾乎是透明的，同時(shí)對常用于細(xì)胞培養(yǎng)中的抗生素不敏感，不引起 pH 變化，不使培養(yǎng)液渾濁，所以支原體污染不容易被發(fā)現(xiàn)，但是其存在會影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

培養(yǎng)多種細(xì)胞時(shí)操作不當(dāng)，會導(dǎo)致細(xì)胞的交叉污染。由于不同細(xì)胞的生產(chǎn)速率不同，污染的生長速率快的細(xì)胞最終會完全取代被污染的細(xì)胞。

13、怎么樣才能減少污染的機(jī)會？

減少化學(xué)污染

對于自己用粉末配制培養(yǎng)液的實(shí)驗(yàn)室來說，配制培養(yǎng)液要使用重蒸餾水，以減少帶入化學(xué)污染的機(jī)會。如果要添加NaHCO3，要選用純度高的NaHCO3，最好是經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)測試的。

另外盡量使用一次性的細(xì)胞培養(yǎng)器皿。由于標(biāo)準(zhǔn)廠家一次性細(xì)胞培養(yǎng)器皿的生產(chǎn)環(huán)境比較嚴(yán)格，得到的產(chǎn)品潔凈度很高，從而減少了由細(xì)胞培養(yǎng)器皿帶入污染的機(jī)會。

減少生物污染

由于一般的污染發(fā)生在細(xì)胞培養(yǎng)的操作過程中，所以良好的細(xì)胞培養(yǎng)操作環(huán)境和操作習(xí)慣是減少生物污染的關(guān)鍵。

要用一個(gè)專門的房間用于細(xì)胞培養(yǎng)，注意保持房間的清潔。

要有一個(gè)定期檢驗(yàn)的合格的超凈臺（超凈臺內(nèi)的潔凈度應(yīng)該為100級，與計(jì)算機(jī)硬盤的生產(chǎn)環(huán)境相當(dāng)）。在使用超凈臺前開啟通風(fēng)裝置并打開紫外燈滅菌30分鐘。操作時(shí)要戴一次性橡膠手套，并噴灑70%酒精消毒。任何帶入超凈臺的非無菌物件都要噴灑70%酒精消毒。收集廢培養(yǎng)液的瓶子要加入漂白粉或漂白液，以避免微生物的生長。每次實(shí)驗(yàn)完后，要向通向廢培養(yǎng)液瓶的塑料管內(nèi)噴灑70%酒精，并且用蒸餾水和70%酒精先后擦拭臺面（只用70%酒精擦拭會導(dǎo)致灑落在臺面的培養(yǎng)液在臺面上形成難以清除的污垢）。

不要在超凈臺里使用酒精燈等燈具，因?yàn)檫@樣會因燈的熱的火焰引起的空氣對流而破壞超凈臺里本來規(guī)則的空氣層流，使本來存在于超凈臺底層的微粒被帶到上層，帶來更多的污染機(jī)會。

加熱培養(yǎng)液的37°C恒溫水浴中非常容易有微生物的生長，從而成為一個(gè)重要的污染源。所以需要定期清洗恒溫水浴。 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)的用于保持濕度的水盤也需要定期清洗。 為了減少不同細(xì)胞株間的相互污染，不要用同一瓶培養(yǎng)液或胰酶培養(yǎng)不同的細(xì)胞；不要在一個(gè)超凈臺上同時(shí)進(jìn)行多種細(xì)胞的操作。 分裝每次小量使用的溶液（如胰酶、抗生素、谷氨酸溶液），以減少多次使用時(shí)污染的機(jī)會。

以防萬一

即使再小心，污染難免還是會發(fā)生。所以得到一個(gè)新的細(xì)胞株后的第一件事情，是把細(xì)胞生長擴(kuò)增后凍存起來，以備不測。 何況一般的細(xì)胞在傳代次數(shù)多了以后，遺傳特性也會發(fā)生改變。通過批量凍存的辦法，可以有效的把培養(yǎng)的細(xì)胞控制在一定的代數(shù)以內(nèi)。

14、內(nèi)毒素是什么？

內(nèi)毒素的化學(xué)成分是脂多糖，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要組分之一。一個(gè)活的細(xì)菌很少釋放內(nèi)毒素，但死后可放出大量內(nèi)毒素。

內(nèi)毒素在血液中存在時(shí)會引起動物發(fā)熱，是醫(yī)療注射液中最主要的熱原。19 世紀(jì) 40 年代開始用注射溶液引起兔的發(fā)熱反應(yīng)實(shí)驗(yàn)來檢測熱原（主要是細(xì)菌內(nèi)毒素）。 后來研究者發(fā)現(xiàn)鱟（一種海洋生物）血液遇到極微量的內(nèi)毒素會發(fā)生凝血反應(yīng)，從而在19 世紀(jì) 70 年代發(fā)明了鱟試劑用于快速精確檢測內(nèi)毒素。內(nèi)毒素含量一般用國際單位（ EU ）來衡量，一般來說 1EU 大致等于 0.1-0.2ng。

由于內(nèi)毒素會對很多種細(xì)胞產(chǎn)生刺激，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以在實(shí)驗(yàn)中要盡量減少在培養(yǎng)液中的內(nèi)毒素的來源。

由于生產(chǎn)工藝的提高，來自標(biāo)準(zhǔn)廠家的血清和培養(yǎng)液中的內(nèi)毒素含量很少。所以現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素的來源主要是水、添加劑、細(xì)胞培養(yǎng)器皿等。傳統(tǒng)的玻璃儀器制備的雙蒸水和通過離子交換柱、活性炭柱和超濾三個(gè)環(huán)節(jié)的純水制備儀制備的超純水都能滿足細(xì)胞培養(yǎng)用水的要求。盛水器具上的細(xì)菌內(nèi)毒素可能給超純水帶來污染。長時(shí)間放置的超純水也可因盛水器具上細(xì)菌生長而污染細(xì)菌內(nèi)毒素。

內(nèi)毒素能緊密的粘在玻璃器皿上，實(shí)驗(yàn)室里用普通的方法不能完全的消除除內(nèi)毒素。用 250 ℃， 30 分鐘或 180 ℃， 2 小時(shí)干熱滅菌能完全除掉玻璃器皿上的內(nèi)毒素。

一次性塑料器皿經(jīng)過高溫注塑成型，沒有內(nèi)毒素存在。但在處理、包裝等生產(chǎn)過程中，可能污染內(nèi)毒素。杭州生友生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等在萬級無塵車間生產(chǎn)和包裝，產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量低于 0.5EU/ml。

15、細(xì)胞的凍存

一個(gè)實(shí)驗(yàn)室得到一個(gè)新的細(xì)胞株后，首先要把該細(xì)胞株培養(yǎng)擴(kuò)增后凍存起來。細(xì)胞凍存首先可以在由于污染等情況丟失細(xì)胞時(shí)有備份可用，另外幾乎所有細(xì)胞在培養(yǎng)傳代的過程中發(fā)生一定程度的變異，為了保持實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致，一般細(xì)胞在培養(yǎng)幾十代以后就不能再使用了，需要將凍存的，傳代較少的細(xì)胞化凍培養(yǎng)再使用。

細(xì)胞冷凍過程有四個(gè)要點(diǎn)：細(xì)胞的收獲、保護(hù)劑的使用、冷凍速率和儲存環(huán)境。

細(xì)胞的收獲

用來凍存的細(xì)胞一般選擇在細(xì)胞約鋪滿 90% 的時(shí)候，這時(shí)細(xì)胞生長狀態(tài)好，細(xì)胞數(shù)量也多，并且在收獲細(xì)胞前 24 小時(shí)換一次培養(yǎng)液。收獲用來凍存的細(xì)胞開始時(shí)方法和平時(shí)一樣，用 100xg 離心 5 分鐘收集細(xì)胞再重懸，活細(xì)胞記數(shù)。稀釋或濃縮到細(xì)胞保存的最終細(xì)胞濃度的二倍（一般是 400-1000 萬 細(xì)胞 /ml ），加入已經(jīng)配好的等體積的培養(yǎng)液保護(hù)劑混合溶液中輕輕混勻，分裝到凍存管，冷凍保存。

保護(hù)劑的使用

細(xì)胞凍存中， 一般使用DMSO 作為保護(hù)劑。在細(xì)胞凍存中， DMSO 使用的最終濃度一般是 5-15% ，某種具體細(xì)胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到。對特別敏感的細(xì)胞特別是雜交瘤細(xì)胞在凍存時(shí)使用 95% 血清和 5%DMSO 可能會好些。保護(hù)劑在使用時(shí)先用培養(yǎng)液或血清配成最終濃度的 2 倍，再與等體積的懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液混合。

細(xì)胞凍存的速率

細(xì)胞的冷凍速率最是控制在讓細(xì)胞有足夠的時(shí)間脫水而又不被過度脫水導(dǎo)細(xì)胞損害。對大多數(shù)細(xì)胞來說，每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的。通常的操作是把細(xì)胞先在-20℃1-2個(gè)小時(shí)，再放入 -80℃冰箱過夜（如果沒有-80℃冰箱，可以用干冰替代），再轉(zhuǎn)入液氮罐或低于 -130℃的冰箱長期保存。

另外一個(gè)辦法是，在-20℃1-2個(gè)小時(shí)以后，把冷凍管懸掉在液氮罐的氣相中，以控制冷卻的速率。這個(gè)方法比較簡單，因?yàn)榧?xì)胞也可以在液氮罐的氣態(tài)中長期保留，所以不用計(jì)時(shí)。對于沒有-80℃冰箱，或者購買干冰不方便的人來說，這是一個(gè)比較好的辦法。

儲存環(huán)境

細(xì)胞長期保存溫度是 -130 ℃或更低。液氮罐中氣態(tài)層溫度在 -140℃至 -180℃之間，細(xì)胞可保存在氣態(tài)層或浸入液氮中，如果可能最好保存在氣態(tài)層，因?yàn)檫@樣可避免由于有液氮進(jìn)入凍存管而在拿出細(xì)胞時(shí)引起爆炸（但是這樣液氮罐內(nèi)只能存儲少量液氮，需要經(jīng)常添加）。細(xì)胞也可以在-80℃冰箱保存幾個(gè)月左右的時(shí)間。

16、怎樣化凍動物細(xì)胞？

化凍過程的原則是要讓凍存的細(xì)胞快速融化。

如果細(xì)胞儲存在液氮液面下，使用者最好準(zhǔn)備好必要的防護(hù)器具（至少要戴上護(hù)目鏡，最好戴上面罩和較厚的手套），防止進(jìn)入凍存管的液氮驟然膨脹引起爆炸而造成傷害(筆者曾經(jīng)在化凍的時(shí)候，為了防止污染，把冷凍管放到一個(gè)15ml離心管中，而且把蓋子擰上了，打算放到 37℃水浴，恰好回過頭去和別人談話，忽然聽到一聲爆炸聲，回頭一看，15ml的離心管就剩下蓋子了，其他的都爆飛了)。從冰箱或液氮罐取出細(xì)胞后將凍存管放 37℃水浴輕輕晃動使之化凍完全，注意不要讓水浸到蓋子以防污染發(fā)生。

由于大多防凍劑與細(xì)胞長時(shí)間接觸時(shí)對細(xì)胞有毒害，所以最好盡快除去細(xì)胞凍存時(shí)加入的防凍劑。

防凍劑的去除方式和細(xì)胞的敏感性有關(guān)。有些細(xì)胞在某些防凍劑存在的條件下能很好的貼壁生長，可以直接將化凍的凍存細(xì)胞連同其凍存液加入預(yù)備好 15-20ml 培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后換培養(yǎng)液。

對于敏感細(xì)胞要加入 10ml 培養(yǎng)液中， 100xg 離心 5 分，去上清后加培養(yǎng)液輕輕重懸細(xì)胞，加入培養(yǎng)器皿后在培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第二天更換培養(yǎng)液。

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