1 方法、機理及影響因素

　　1.1 應用的方法目前，美國藥品食品管理局（FDA）承認3種鱟試劑檢測細菌內毒素含量的方法，即凝膠（gelclot）法、生色（chromogenic）法和動態濁度（keniticturbidimetry）法［2］。近年來較新的方法有水箭電泳免疫法（測殘余蛋白）、酶聯免疫吸附法（測殘余酶）。后者所需鱟試劑僅相當于凝膠法的1/100，且靈敏度更高，抗干擾能力更好。《中國藥典》1995年版只采用凝膠法。凝膠法是將等體積的供試品溶液和新配制的鱟試劑（TAL）溶液在試管中混勻，一般各0.1 ml，（37±1）℃反應（60±2）min。如果被檢測的溶液不含干擾凝集反應的因素，且其含有內素素濃度等于或大于所用鱟試劑的靈敏度（λ）時，就會在試管中顯示陽性反應，即形成凝膠；否則呈陰性反應，即呈澄明溶液或輕度混濁，視內毒素的濃度而定［1］。該反應極其靈敏，凝膠形成速率與內毒素濃度成正比，并受溫度、反應物中Ca2 /Mg2 離子濃度和pH等因素的影響［3］。同樣，《中國藥典》2000年版也只采用凝膠法。 淘金者.taojz.com

　　1.2 凝膠法鱟試劑與內毒素反應的機理見圖1。

　　圖1 凝膠法鱟試劑與內毒素反應的機理（略）

　　2 影響細菌內毒素檢查的因素

　　2.1 檢品的干擾pH值、離子濃度以及某些干擾成分，都會影響到檢查結果的準確性，得到所謂“假陽性”或“假陰性”結果。只有證實檢品對凝集反應無干擾之后，檢查的結果才是可信的。判斷檢品是否有干擾要做檢品的干擾實驗。

　　2.2 鱟試劑的非特異性內毒素不是唯一能激活鱟試劑凝集系統的物質，還有其他物質可以通過G因子這個“旁路”激活鱟試劑的凝集系統。因此鱟試劑并不是專一對內毒素反應的試劑。由旁路反應產生的陽性結果稱細菌內毒素檢查的“假陽性”。

　3 特殊值的確定

　　3.1 藥品的內毒素限值（L）藥品細菌內毒素檢查是一種限度實驗，首先必須確定供試品的細菌內毒素限值。當供試品含內毒素低于這個限值時，按規定給藥途徑用藥，就不會引起致熱原反應；相反就有可能引起熱原反應［1］。藥品細菌內毒素限值確定的方法有3種。

　　3.1.1 藥典給出藥典規定細菌內毒素檢查的品種，在藥典正文可以查到相應的L值。《中國藥典》1995年版規定了12種注射劑的L值，2000年版規定了47種注射劑的L值，USPXXⅢ規定了471種注射劑的L值。

　　3.1.2 根據熱原檢查的兔劑量計算L=K/M，M規定的給藥途徑，藥品的家兔注射劑量，以ml/kg，mg/kg，μ/kg等表示；K為規定的給藥途徑；臨床無任何不良反應的內毒素閾值，以Eu/kg表示。靜脈（包括im，ip，sc，ia）：5.0 Eu/kg；放射性藥品：2.5 Eu/kg；鞘內：0.2 Eu/kg。

　　3.1.3 根據人的最大注射劑量計算L=K?W/M，M為規定的給藥途徑，人的最大注射劑量同樣以ml/kg，mg/kg，μ/kg等表示；W為人的平均體重，中國成人按60 kg計算。

　　3.2 藥品的最大有效稀釋（MVD）做藥品的細菌內毒素檢查時，當品種的L值與所選用的鱟試劑靈敏度（λ）相等時，若經干擾實驗證實無干擾，可以直接檢查。但許多藥品的L值往往大于鱟試劑的靈敏度（L＞λ），在這種情況下，若直接檢查，得到陽性結果并不能說明該藥品的內毒素含量超過限值。因此，當L＞λ，需要對檢品作適當的稀釋，但稀釋的倍數不能超過一個有效的限度，這就是“最大有效稀釋”，用MVD表示。其計算公式如下：MVD=L/λ。

　　4 重要的實驗――預實驗

　　4.1 鱟試劑標示靈敏度的復核實驗鱟試劑是一種有生物活性的試劑，其穩定性受多種因素的影響，藥品的細菌內毒素檢查又是關系到藥品安全性的重要檢查項。因此各國的細菌內毒素檢查法都規定：每批鱟試劑在用于細菌內毒素檢查前都必須對該批試劑標示的靈敏度進行復核。當復核的靈敏度值λ0在標示值λ的0.5~2.0λ范圍（即0.5λ≤λ0≤2.0λ），方可用于細菌內毒素檢查，并且要按標示值使用。

4.2 檢品的干擾實驗

　　4.2.1 干擾實驗的目的判斷某個品種在某種濃度狀態下是否宜作細菌內毒素檢查，就需要對其作干擾實驗。要求至少對每個廠家連續生產的3~5個批號（不包括亞批）的供試品進行干擾實驗，若鱟試劑的來源以及供試品的配方有變化或生產工藝改變時，須重復進行干擾實驗［6］。《美國藥典》的細菌內毒素檢查法及FDA關于鱟試劑的準則規定，用鱟試劑方法檢查任何一種藥品的內毒素含量之前，至少要做3批成品的干擾實驗，如果鱟試劑的來源或制造工藝改變，或藥品的生產工藝、處方、成分改變，要重做干擾實驗；如果藥品的特殊組分的來源或鱟試劑的批號改變，要用陽性產品對照來復檢鱟試劑方法對這一產品的檢查有效性。

　　4.2.2 干擾實驗的原理干擾實驗在《美國藥典》的細菌內毒素檢查法中稱為抑制或增強實驗。其原理是比較鱟試劑與內毒素的反應在水溶液中進行和在檢品中進行的差異。也就是比較反應在不同介質中進行的差異無差異即無干擾，有差異即有干擾。

　　4.2.3 干擾實驗的方法干擾實驗是由兩部分實驗組成：其一是鱟試劑與內毒素在水溶液中的反應實驗，這部分與鱟試劑的靈敏度復核實驗完全相同。其二是鱟試劑與內毒素在檢品溶液中的反應實驗，也就是在檢品中加入相應量的內毒素（或者說用檢品的溶液來稀釋內毒素），用來做鱟試劑靈敏度的“復核”，比較鱟試劑在不同介質中對內毒素的“靈敏度”是否一致。

　　4.2.4 陽性產品對照用SMVD復溶鱟試劑，然后加入2 λ濃度的標準內毒素溶液與之反應，若反應結果為陰性，說明檢品對檢查有抑制作用。若反應結果為陽性，說明檢品對檢查無抑制作用，但并未能表示無增強作用。 淘金者論文范文中心

　　5 應用前景

　　細菌內毒素檢查法作為一種新技術載入藥典，成為一種法定的藥檢方法，反映了藥典標準水平、藥檢技術水平的提高，標志著一個國家制藥工業水平及藥品質量的提高。隨著歷史的發展，必將有更多國家的藥典收載細菌內毒素檢查法。它具有方法多樣化、自動化、微量化的特點。細菌內毒素檢查法所具有的優點表明它比家免熱原檢查法更適應現代制藥工業的發展。它可以應用于藥檢，也可以用于藥品生產質量控制、臨床診斷及其它領域。該法用于藥品成品的檢查，屬于一種事前控制的質控手段，對提高藥品質量，避免造成藥品成批報廢有重要意義；在臨床上可作為快速診斷革蘭氏陰性細菌感染的疾病的一種輔助方法，但不能區分病原體。其它在食品衛生、環境保護、電子工業（如超純水的檢查）等領域也涉及到細菌內毒素檢查的應用。

參考文獻：

　　［1］ 黃清泉,夏振民.藥品細菌內毒素檢查的實驗設計［J］.中國藥學雜志,1997,32(2):72.

　　［2］ 王茂林.鱟試劑法檢查熱原的應用范圍［J］.中國醫院藥學雜志,1990,10(4):41.

　　［3］ 高國政,顏錦.pH值影響細菌內毒素測定的實驗室研究［J］.中國藥學雜志,1998,18(3):162. 淘金者論文范文中心

　　［4］ 郭錄平.淺談影響鱟試驗的因素［J］.中國藥學雜志,1996,31(3):187. :淘金者論文范文是你生活，學習的好助手

　　［5］ 國家藥典委員會.中國藥典，Ⅱ部［S］.北京：化學工業出版社，2000：附錄86.

　　［6］ 中華人民共和國衛生部藥典委員會.中國藥典，Ⅱ部［S］.北京：化學工業出版社，1995：附錄XXⅢ.
 

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