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ELISA技術(shù)的質(zhì)量控制
概述
Engvall和Perlmann于1971年首先建立了酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）。隨著科技的發(fā)展，ELISA在抗原、抗體、酶、固相載體及包被技術(shù)等方面都有較大的進(jìn)步，其靈敏度和特異性均大大提高。由于該技術(shù)具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點，因而已被廣泛應(yīng)用于各行業(yè)。盡管如此，ELISA在應(yīng)用過程中仍然存在著許多難點，必須嚴(yán)格控制才能保證檢測的質(zhì)量。
ELISA質(zhì)量保證是一個復(fù)雜的過程，許多重要的環(huán)節(jié)都影響到檢測的質(zhì)量。現(xiàn)分述如下：
一、方法學(xué)的影響
ELISA測定模式包括以下幾種：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競爭抑制法，其中競爭抑制法因受操作時差所引起的不公平競爭等因素的影響，結(jié)果重復(fù)性較差，質(zhì)量較難控制。
二、試劑因素
1.試劑的選擇
免疫檢測的原理均基于抗原抗體反應(yīng)。由于該反應(yīng)過程受多種因素的影響，如普遍存在基質(zhì)效應(yīng)、交叉反應(yīng)等，因而檢測結(jié)果難以溯源，不同方法、不同試劑之間甚至同一試劑不同批號間結(jié)果均缺乏可比性。試劑質(zhì)量在很大程度上決定了檢測的水平，因此在引入新項目之前必須對試劑進(jìn)行嚴(yán)格的評估。試劑的評估有以下幾個步驟：⑴確定開展該項目的必要性；⑵了解該項目現(xiàn)有的檢測方法和原理；⑶在了解試劑的組成基礎(chǔ)上選擇多家試劑盒進(jìn)行比較，判斷標(biāo)準(zhǔn)首選參考方法或參考物質(zhì)，其次為臨床的滿意度及權(quán)威機構(gòu)的報告如各級室間質(zhì)量評價、CDC報告等；⑷定期對檢測結(jié)果進(jìn)行追蹤反饋直至最終認(rèn)可該試劑。
2.試劑的準(zhǔn)備
不同批次的ELISA試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量完全一致，即使是通過批批檢的項目其檢測結(jié)果也存在差異，因此必須選擇和訂購長批號的試劑，并保證保存條件。嚴(yán)格執(zhí)行這一標(biāo)準(zhǔn)可以避免因試劑批號改變而重新建立質(zhì)控體系及重新評估試劑的復(fù)雜過程，并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性；對于效期短、使用率低的試劑，應(yīng)當(dāng)小量分裝，每次使用則取分裝部分即可，避免反復(fù)凍融造成試劑的失效。
試劑使用前必須平衡至室溫，否則會影響檢測下限。未用完的室內(nèi)質(zhì)控品及本次不需使用的試劑應(yīng)密封并及時放回冰箱保存。
三、樣本因素
標(biāo)本干擾因素包括內(nèi)源性干擾因素和外源性干擾因素，前者包括類風(fēng)濕因子、補體、異嗜性抗體、自身抗體、溶菌酶等，后者包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時間過長、標(biāo)本凝固不全、冷凍標(biāo)本的反復(fù)凍融等。其中外源性干擾因素是我們在檢測過程中可以避免也是必須避免的因素，而避免內(nèi)源性因素的干擾則主要通過選擇合適的試劑盒。在臨床中遇到少見的疑難病例時應(yīng)當(dāng)考慮到內(nèi)源性干擾因素的存在。以下對外源性干擾因素進(jìn)行簡要說明：
1.標(biāo)本溶血 要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其具有類過氧化物的活性，因此，在以辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）為標(biāo)記酶的ELISA測定中，如果血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色。
2.標(biāo)本被細(xì)菌污染 標(biāo)本的采集及血清分離要注意盡量避免細(xì)菌污染。細(xì)菌菌體中除可能含有內(nèi)源酶對測定產(chǎn)生非特異性干擾外，還可能對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用。另外標(biāo)本在保存中出現(xiàn)渾濁或絮狀物時，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。
3.標(biāo)本貯存時間過長 標(biāo)本在低溫下保存時間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底加深、甚至出現(xiàn)假陽性結(jié)果。通常情況下血清標(biāo)本可在2～8℃下保存l周，冷凍保存時間會更長，但對于抗體或抗原含量低的標(biāo)本而言，則可能會因抗體掉價、抗原分解而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
4.標(biāo)本凝固不全 血液通常在采集后半小時后開始凝固，18～24h完全凝固。如果在血液未凝固時即離心分離血清，則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結(jié)果。為了縮短標(biāo)本處理時間，可以在離心前將血液標(biāo)本置于溫箱中溫育或者采用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽┮约铀傺宓姆蛛x。
5.冷凍保存標(biāo)本避免反復(fù)凍融 標(biāo)本的反復(fù)凍融會因其所產(chǎn)生的機械剪切力對標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，使抗體效價跌落從而引起假陰性結(jié)果，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝凍存。此外，標(biāo)本在凍存時會因蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，因此重新融解的標(biāo)本必須混勻，但不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒即可。
四、操作因素對ELISA結(jié)果的影響
ELISA測定一般遵循以下步驟：固相包被→加樣品→溫育→洗滌→加酶結(jié)合物→溫育→洗滌→加底物→溫育→顯色→終止顯色→比色
目前各種形式的ELISA自動分析儀已經(jīng)進(jìn)入市場，如廣泛應(yīng)用于血站系統(tǒng)的微板式全自動酶免分析儀，其試劑為開放式的，而對于其它類型的儀器，則試劑和儀器往往是配套的。但當(dāng)前大部分醫(yī)學(xué)實驗室均采用手工操作加儀器測定的方式。ELISA操作步驟復(fù)雜，操作不當(dāng)將引起較大的誤差。以下敘述各個步驟中的影響因素。
1.加樣
加樣器是一種比較精密的工具，其在長時間使用時會因機械磨損或者推動桿內(nèi)附著血痂等原因造成加樣不準(zhǔn)，尤其是對于樣本量較大的臨床實驗室，因此必須定期對加液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。每次加不同的標(biāo)本時均需更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。加樣時速度不可太快，避免將標(biāo)本加在孔壁上部 ，并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡。加樣時還應(yīng)當(dāng)注意操作時差對結(jié)果的影響，操作時差是指加入標(biāo)本、試劑及混勻時間的差異。操作時差在每個實驗中都存在，尤其是手工操作，日常檢測標(biāo)本多達(dá)幾百個，從加入第一個標(biāo)本到最后一個標(biāo)本，需幾十分鐘，加入試劑及混勻等均存在著前后的時間差異，使抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)時間不一致，操作時差對競爭法檢測的結(jié)果影響更大，在加酶結(jié)合物和底物時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。如果使用滴瓶除注意滴加的角度外還要注意滴加的速度，速度太快，容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或者加在兩孔之間，造成非特異性吸附。另外有些項目在檢測前需要稀釋以減低非特異性反應(yīng)，但稀釋的方式非常重要，如果采用手工稀釋則容易因操作者個體差異而產(chǎn)生不一致的結(jié)果，尤其是吸光度處于臨界值附近的標(biāo)本，因此最佳的方式是采用振蕩器混勻。
2.溫育
在 ELISA檢測中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫 育(incubation)。
溫育常采用的溫度有 43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的溫育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的最適反應(yīng)溫度。有實驗表明，抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1～2小時產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為加速反應(yīng)，可在一定范圍內(nèi)提高反應(yīng)的溫度并在反應(yīng)過程中連續(xù)振蕩以增加抗原抗體接觸的機會。抗原抗體反應(yīng)在4℃反應(yīng)更為徹底，形成的產(chǎn)物更多更穩(wěn)定，但因所需時間太長，在ELISA檢測中一般不予采用。
溫育的方式有溫箱法、微波輻射法、水浴法等，其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（這種現(xiàn)象被稱為“邊緣效應(yīng)”）。若用溫箱溫育則ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。采用這種溫育方式的關(guān)鍵是必須保證濕盒內(nèi)的溫度達(dá)到反應(yīng)的要求，可在反應(yīng)前將濕盒預(yù)溫至規(guī)定的溫度，并用溫度計監(jiān)測反應(yīng)過程。采用水浴時，將ELISA板置于水浴箱中，板底貼著水面。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋或用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。溫育過程中，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腅LISA試劑盒一般都規(guī)定了明確的溫育溫度，若要求室溫溫育，則一般是指20～25℃。微波輻射法能縮短溫育時間，但不能解決“邊緣效應(yīng)”，因而較少使用。
3.洗滌
洗滌是ELISA測定過程中決定實驗成敗的一個關(guān)鍵步驟。其目的是去除反應(yīng)體系中與反應(yīng)無關(guān)的成分、未結(jié)合的酶結(jié)合物以及反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。由于抗原和抗體的包被通常是在堿性條件下與固相的疏水鍵相互作用而被動吸附于其上的，因此必須注意非離子去垢劑的使用濃度，最常用的洗滌液是含0.05％吐溫20的0.02mol/L， pH 為7.4的 PBS液，如果洗滌液中的吐溫20超過 0.2％，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響實驗的測定下限。
洗滌可采用洗板機或手工洗滌兩種方式，手工洗板則分為浸泡式和流水沖洗式洗滌。無論洗板方式如何，在向板孔內(nèi)注液時應(yīng)當(dāng)避免氣泡殘留孔內(nèi)，否則會因洗滌液難以進(jìn)入孔中而影響洗滌效果。在采用洗板機洗板時，一定要將板條平放于板架上，保證洗板機上的每個吸液針都能一致地插入板孔底部將洗液完全吸凈，否則空白值將升高甚至出現(xiàn)“花板”現(xiàn)象（背景不干凈），造成實驗失敗，尤其是當(dāng)酶結(jié)合物非特異吸附而殘留于板孔時。若采用手工洗板，則可在每次棄去板孔內(nèi)液體后將反應(yīng)板于布料上拍干，布料可在消毒洗滌后重復(fù)使用。
手工洗板一般為3～5次，使用洗板機洗板時，其所需次數(shù)可通過以下實驗確定：選擇8×12 HBsAg ELISA包被板條，在每孔中平行加入相同的一份弱陽性血清，按試劑盒說明加入酶結(jié)合物并完成溫育，洗板機設(shè)置如下：第1次洗滌1排、第2次洗滌2排、第3次洗滌3排……直至8次洗滌8排，每次只洗滌1遍，其結(jié)果是第1排洗滌了8遍，第2排洗滌7遍……第8排洗滌1遍，加底物顯色后，根據(jù)吸光度值不再改變的反應(yīng)條的洗滌次數(shù)來確定最佳的洗板次數(shù)，例如第3排反應(yīng)條吸光度值不再改變，則認(rèn)為該項目最佳洗滌條件為6遍。另外有三方面必須注意：一是在使用洗板機洗板時，通常在上機前應(yīng)先將反應(yīng)液棄去并用流水快速沖洗1遍，避免因反應(yīng)液對洗板機管道污染而造成的交叉污染和背景顏色加深，但對于粘性大的稀釋液或反應(yīng)液而言，則需直接上機洗滌，并增加洗板后清水沖洗管路的次數(shù)；二是對于兩步法而言第一步洗滌次數(shù)不宜太多，否則將降低結(jié)果的吸光度值。
4.顯色
顯色是 ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，在以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中，主要采用TMB和OPD兩種底物，其中以TMB最為多見，TMB底物顯色一般要求室溫或37℃反應(yīng)15～30分鐘。研究表明，顯色受時間和溫度的影響，一般37℃反應(yīng)30分鐘可使顯色充分，如果縮短反應(yīng)時間或者降低反應(yīng)溫度均可影響檢測的下限。為了保證結(jié)果的穩(wěn)定性，必須固定顯色時間和溫度，但不少操作者往往忽略了這一點。TMB顯色體系的A液和B液可在使用前先混合然后用排槍加入反應(yīng)孔中，這樣既節(jié)省人力又縮短了操作時差對結(jié)果的影響。反應(yīng)液應(yīng)新鮮配制并且避免接觸金屬器皿，否則可因氧化等原因產(chǎn)生顏色反應(yīng)。OPD由于其具有致癌性目前已很少使用。
5.比色
ELISA顯色的結(jié)果必須通過酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，有兩個重要的原因：一是不同的個體的色覺存在差異，如果僅憑肉眼判斷，則結(jié)果重復(fù)性差，并且難以形成統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)，尤其是對于HBeAb、HBcAb這樣的檢測項目；二是日益頻繁的醫(yī)療糾紛要求臨床實驗室必須對ELISA檢測的原始吸光度值，陰陽性判斷結(jié)果等原始數(shù)據(jù)進(jìn)行保存，否則面對醫(yī)療糾紛時將無法舉證。
TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止，各類酸性終止液則將藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色。有實驗表明，從終止反應(yīng)后2分鐘開始，樣本的吸光度值逐漸下降，起始吸光度值越高其下降速度越快，為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在終止反應(yīng)后2分鐘內(nèi)讀取吸光度值。
酶標(biāo)儀應(yīng)采用雙波長進(jìn)行測定，必須包括對顏色產(chǎn)物敏感和不敏感的兩個吸收峰波長，在非敏感波長處測定特異性顯色的吸光度值接近為零，此時測的吸光度值為容器上的劃痕、指印、背景等造成的光干擾。以TMB底物為例，其最大吸收的波長為450nm，非敏感波長為630nm，雙波長檢測最終得到的吸光度值為兩者之差。雙波長測定能去除背景的干擾，一般不設(shè)空白孔，否則會出現(xiàn)吸光度值為負(fù)值的現(xiàn)象。
酶標(biāo)儀的使用需強調(diào)儀器的維護(hù)和保養(yǎng)，酶標(biāo)儀首先應(yīng)放置通風(fēng)處，避免機器內(nèi)部尤其是濾光片發(fā)霉，在使用過程中避免酸等物質(zhì)溢出腐蝕儀器，每半年或一年請計量局對酶標(biāo)儀進(jìn)行檢定，并請廠商定期維護(hù)。比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體。酶標(biāo)儀在使用前應(yīng)先預(yù)熱15～30分鐘，測讀結(jié)果會更穩(wěn)定。
五、灰區(qū)的設(shè)置
通常情況下，ELISA定性實驗以“陽性”和“陰性”來報告結(jié)果，兩者間有一條分界線被稱為“陽性判斷值”（cut-off value，CO值），這是定性免疫測定結(jié)果報告的依據(jù)。由于ELISA CO值的設(shè)置不能區(qū)分所有正常和異常的人群，尤其是位于CO值附近的人群，并且ELISA檢測具有以下幾個特點：檢測變異大（18%～65%）；不同試劑盒CO值存在差異；病毒感染存在窗口期；病毒變異后表達(dá)產(chǎn)物含量低以及個體差異等，因此在CO值附近存在一個臨床意義可疑的的區(qū)域被稱之為“灰區(qū)”，在國內(nèi)的傳染性病原體抗原和抗體檢測的ELISA試劑盒中均未涉及“灰區(qū)”的設(shè)置，但僅僅依靠CO值來決定感染的有無，尤其是對獻(xiàn)血員的篩查具有較大的風(fēng)險。因此對于檢測結(jié)果位于“灰區(qū)”的病人可采用確認(rèn)實驗或追蹤檢測的辦法加以確診。
目前“灰區(qū)”的設(shè)置有二種方式：⑴CO×（1±CV）， CV為該試劑的批內(nèi)CV (一般在15-20%)；⑵CO±2s，s為實驗室做室內(nèi)質(zhì)控ROC（常規(guī)條件下的變異）的標(biāo)準(zhǔn)差。
六、標(biāo)本復(fù)查
ELISA手工檢測過程復(fù)雜，影響因素較多，即使室內(nèi)質(zhì)控在控，也可能因孔間差異而造成結(jié)果的差異，因此加大復(fù)查力度是保證結(jié)果準(zhǔn)確性的可靠方法，比如對HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等項目的可疑、弱陽性標(biāo)本及少見模式的檢測結(jié)果進(jìn)行復(fù)查。
復(fù)查方式主要有兩種：一是采用同一種試劑復(fù)查，理由是市售試劑均通過國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）認(rèn)可，嚴(yán)格按照其說明書操作，檢測結(jié)果具有法律效應(yīng)，若使用不同的試劑（非確證試驗）復(fù)查，當(dāng)結(jié)果不相符合時，則最終結(jié)果難以判斷（免疫檢測缺乏“金標(biāo)準(zhǔn)”）。另一種復(fù)查方式是采用國外進(jìn)口試劑進(jìn)行復(fù)查，其理由是盡管進(jìn)口試劑并不是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但實驗室已經(jīng)對此高度重視，并且使用了質(zhì)量較好，價格較貴的試劑，但該法對于小醫(yī)院而言則很難實施。
七、結(jié)果判斷和報告
常用下列幾種方法表示結(jié)果：
1.定性測定
(1)陽性判定值法(cut-off value，CO)：一般為陰性對照的平均A值加一個常數(shù)，試劑制備、檢測過程必須嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化，要先計算出陽性對照A值平均數(shù)和陰性對照A值平均數(shù)。標(biāo)本A值≥陽性判定值為陽性。陽性判定值公式中的常數(shù)是在特定的檢測系統(tǒng)中通過對大量標(biāo)本的實驗檢測而得到的。現(xiàn)以HIV檢測試劑盒為例。NC=陰性質(zhì)控對照的A值；PC1=抗-HIV-1陽性質(zhì)控對照的A值；PC2=抗-HIV-2陽性質(zhì)控對照的A值；NC值的要求：⑴NC必須小于0.250。去掉大于等于0.250的陰性質(zhì)控對照。⑵計算留下的陰性質(zhì)控對照的平均值（NCx）。⑶NC必須在0.6NCx和1.4NCx之間。去掉NC小于0.6NCx和大于1.4NCx的陰性質(zhì)控對照。實驗滿足下列條件有效：⑴多于半數(shù)的陰性質(zhì)控對照符合要求（一般為1個PC，3個NC）；⑵PC1-NCx≥0.400；⑶PC2-NCx≥0.400(如果使用)。如果實驗有效，CO=NCx+0.100,樣品A值大于等于CO，判定為有活性反應(yīng)。樣品A值小于CO，判定為無活性反應(yīng)。根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到了質(zhì)控的作用，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會產(chǎn)生“實驗無效”的后果。由此可以看出為了避免檢測結(jié)果受單孔陽性或者陰性對照的影響（當(dāng)參與CO計算時），必須設(shè)立多孔對照、合理布局，并限定取舍條件。
(2)S/C（待測標(biāo)本A值／校準(zhǔn)品A值）：S/C≥1.1為陽性，S/C＜0.8為陰性；S/C≥0.8但＜1.1為可疑，反應(yīng)體系中陽性、陰性對照及校準(zhǔn)品檢測的吸光度必須落在規(guī)定的范圍內(nèi)，結(jié)果才有效。
(3)S/N值法(待測標(biāo)本A值／陰性對照A值)或S／Co值法：通常S／N≥2．1 ，S／Co≥1為陽性。
(4)抑制率法：在競爭抑制法中結(jié)果可用抑制率表示。抑制率（％）＝（陰性對照A值-標(biāo)本A值）/陰性對照A值×100%，一般以抑制率≥50%為陽性。
2.半定量測定 結(jié)果一般以滴度表示。將標(biāo)本連續(xù)稀釋后，進(jìn)行ELISA檢測，在陽性臨界值以上的最高稀釋度即為該標(biāo)本的“滴度”。
3.定量測定 即用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品作一系列稀釋后進(jìn)行ELISA測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以絕對量或單位表示。在ELISA定量檢測中每一塊反應(yīng)板都必須繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4.結(jié)果報告
傳統(tǒng)的ELISA結(jié)果只報告“陽性”或者“陰性”，但不能解決“灰區(qū)”的問題，因此引入“可疑”的報告方式是比較合理和科學(xué)的，同時對結(jié)果做必要的說明，如“結(jié)果已經(jīng)復(fù)查，建議定期復(fù)查或定量檢測”；對于HBeAb、HBcAb檢測，由于各試劑盒CO值差異及變異系數(shù)大等因素，結(jié)果缺乏可比性，位于CO值附近的標(biāo)本復(fù)查結(jié)果陰陽性只是概率事件，另外HBcAb存在原倍和1：30檢測模式及定量檢測模式，報告結(jié)果的不一致對于臨床實驗室來說是不可回避，也是目前醫(yī)療糾紛主要集中點和“結(jié)果互認(rèn)”的最大障礙，因此在減小室內(nèi)變異的同時必須引入陽性和弱陽性的報告方式。
八、原始記錄
ELISA檢測結(jié)果變異大，不同體系難以溯源，因結(jié)果不一致而引起的醫(yī)療糾紛逐日增多，因此ELISA檢測的原始存根必須完整而全面地保存，包括布局，原始吸光度值，檢測的陰陽結(jié)果，檢測者，試劑廠家，批號，質(zhì)控品來源及批號等。嚴(yán)禁人為修改檢測結(jié)果。
九、質(zhì)量控制
1.室內(nèi)質(zhì)量控制（室內(nèi)質(zhì)控）
ELISA定性試驗的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關(guān)，因此質(zhì)量控制（quality control, QC）要保證試驗的靈敏度和重復(fù)性。目前定性實驗的質(zhì)控規(guī)則還還存在爭議，目前有以下幾種比較流行的理論：
⑴室內(nèi)質(zhì)控品
室內(nèi)質(zhì)控品的穩(wěn)定以及合適的濃度是運用一切質(zhì)控規(guī)則的前提。可選擇S/CO值減去精密度測定中得到的三倍批間CV%（通常的ELISA測定批間變異（CV%）在15%左右）與該S/CO值的乘積（意即三倍SD）仍大于1的質(zhì)控血清作監(jiān)測重復(fù)性的室內(nèi)質(zhì)控品用。 計算公式：S/CO（1-3CV%）=S/CO-3SD。同時選擇S/CO處于1.5左右的質(zhì)控血清以判斷每次測定時試劑盒測定下限的有效性。
⑵ “即刻性”質(zhì)控
一些實驗室不是每天進(jìn)行ELISA項目的檢驗，而ELSIA部分試劑盒效期短 ，用同一批號試劑盒連續(xù)常規(guī)測20次，難度較大。采用"即刻法"質(zhì)控統(tǒng)計方法，只需連續(xù)測3次，即可對第3次檢驗結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。①先將測定值從小到大排列，X1最小，Xn最大 ；②計算X和s；③計算SI上限值和下限值。SI上=（X最小-X）/S，SI下=（X最大-X）/S；④對照SI表，檢查是否出控。SI上、下限≤規(guī)定值，在控； SI上或下限>規(guī)定值，失控。
⑶Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法 Levey-Jennings質(zhì)控圖以及Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法最早應(yīng)用于生化檢測的質(zhì)量控制，在ELISA檢測中仍為探索階段，一般認(rèn)為：①一 次超出3SD；②連續(xù)二次超出2SD；③3～5次連續(xù)處于一側(cè)的2SD之內(nèi)；④5～7次連續(xù)偏向橫軸的一側(cè)，均為失控。目前多采用一次超過2SD作為“告警”，一次超出3SD為“失控”。
另外還有Westgard多規(guī)則質(zhì)控規(guī)則、累積和（CUSUM）質(zhì)控規(guī)則等質(zhì)控方法。
⑷衛(wèi)生部臨床檢驗中心確定的質(zhì)控方法：
室內(nèi)質(zhì)控品：定性測定的室內(nèi)質(zhì)控品，除了試劑盒附帶的陰陽性對照外，實驗室還應(yīng)該選擇至少2個室內(nèi)質(zhì)控品，其中一個為弱陽性質(zhì)控品，接近Cutoff值，S/Co值應(yīng)該為2～4之間；另一個為陰性質(zhì)控品。定量測定則至少要求一個水平的質(zhì)控品。
測定頻度：每臺儀器，每次檢測患者樣本時至少測定一次室內(nèi)質(zhì)控品；ELISA測定每塊板都要測定室內(nèi)質(zhì)控品。
質(zhì)控圖繪制：定性測定可采用弱陽性質(zhì)控品的S/Co值作質(zhì)控圖。定量測定參照臨床化學(xué)的繪制方法。質(zhì)控判斷規(guī)則：定性測定為弱陽性的質(zhì)控品不能測定為陰性；陰性質(zhì)控品不能測定為陽性。重復(fù)性的判斷規(guī)則為12S（警告限），13S為失控限。定量測定參照臨床化學(xué)的判斷規(guī)則。
⑸室內(nèi)質(zhì)控的現(xiàn)狀及應(yīng)對措施
免疫質(zhì)控品制作困難，不管是自制血清或者購于其它機構(gòu)，其穩(wěn)定性和濃度很難達(dá)到要求，加之ELISA影響因素較多，失控后很難找到確切的原因。因此如何開展ELISA室內(nèi)質(zhì)控一直困擾著臨床檢測者。基于此，不同實驗室采取了不同的應(yīng)對措施，舉例如下：①選擇衛(wèi)生部臨床檢驗中心（NCCL）的低值質(zhì)控血清作為室內(nèi)質(zhì)控品，儲備量以3個月，采用一次超過2SD作為“告警”，一次超出3SD為“失控”的質(zhì)控規(guī)則，（但該法對于HBeAb（4NCU/ml）、 HBcAb(2NCU/ml)檢測不適用，因為即使質(zhì)控在控，其結(jié)果也可能為陰性）；②由于質(zhì)控品不穩(wěn)定，每個月需重新設(shè)立靶值 ，并根據(jù)常規(guī)CV設(shè)定SD（SD= ×CV¯）；③陰陽性對照正常，室內(nèi)弱陽性和陰性質(zhì)控正常，且沒有出現(xiàn)“花板”（洗板不干凈，背景顏色深）的情況下認(rèn)為該檢測批有效，但仍需對位于“灰區(qū)”和弱陽性的HBsAg、HBeAg結(jié)果及少見模式結(jié)果進(jìn)行復(fù)查，避免偶然因素及孔間差對結(jié)果造成影響；④若陰陽性對照、陰性質(zhì)控異常，或出現(xiàn)“花板”的情況則必須整批復(fù)查；⑤在陰陽性對照、陰性質(zhì)控正常且未出現(xiàn)“花板”的情況下，弱陽性質(zhì)控S/Co超出-3SD時復(fù)查位于“灰區(qū)”標(biāo)本，超出+3SD時則復(fù)查弱陽性標(biāo)本；⑥對于抗體檢測，尤其是競爭法檢測HBeAb、HbcAb，由于不同試劑盒、不同檢測方法間CO值存在差異及變異系數(shù)大等因素，結(jié)果缺乏可比性，失控后的處理很難滿意地解決，在沒有統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)、較小的變異系數(shù)及明確的臨床意義的情況下，引入弱陽性報告方式在臨床實踐中證明可行；⑦室內(nèi)質(zhì)控的評價：認(rèn)真分析每一次室內(nèi)質(zhì)控失控的原因，并對各項檢測的均值，CV等進(jìn)行月與月之間的比較分析，及時發(fā)現(xiàn)試劑盒檢出能力的變化及操作中存在的問題，并采取適當(dāng)?shù)拇胧﹣硖岣邫z測的精準(zhǔn)性。
2.室間質(zhì)量評價（室間質(zhì)評）
室間質(zhì)評是一種回顧性評價，主要是控制實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，也是某些定量實驗量值的溯源。作為臨床實驗室應(yīng)當(dāng)積極參與各級室間質(zhì)評計劃，其要點是保證同病人標(biāo)本一樣對待室間質(zhì)評物。必須強調(diào)的是室間質(zhì)量評價結(jié)果必須同室內(nèi)質(zhì)控一并分析，查找原因以期改進(jìn)工作中的不足，同時指導(dǎo)實驗室選擇合適的試劑盒。
十、免疫檢驗存在的問題
HBV基因組變異對病毒HBsAg和HBeAg測定影響問題，以及如何評價試劑盒對這些變異株的檢測效能；HBcAb檢測在保證輸血安全中的意義；HBeAb、HBcAb溯源性問題；HBcAb檢測模式的問題等均困擾著臨床檢測者。
[1] 李金明. 臨床酶免疫測定技術(shù). 第1版. 北京：人民軍醫(yī)出版社，2005：87-105.
[2] 沈霞. 臨床免疫學(xué)與免疫學(xué)檢驗新技術(shù). 第1版. 北京：人民軍醫(yī)出版社，2002：12-19.
[3] 陶義訓(xùn).免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗.第二版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1999：140.
[4] 李金明. 乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物測定及結(jié)果解釋的若干問題. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，29（5）：385-389.
[5] 衛(wèi)生部臨床檢驗中心，中國醫(yī)院協(xié)會臨床檢驗管理專業(yè)委員會. 《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》及配套文件，2006：10-11.
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