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ELISA簡介：酶聯免疫吸附試驗（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay， ELISA）于1971年分別由瑞典學者和荷蘭學者報道，開創了運用酶標記免疫技術進行液體標本中微量物質測定的實驗方法。基本原理是把抗原或抗體在不損壞其免疫活性的條件下預先結合到某種固相載體表面，測定時，將受檢樣品（含待測抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按一定程序與結合在固相載體上的抗原或抗體起反應形成抗原或抗體復合物，經洗滌去除反應液中其他物質，加入酶反應底物后，在酶的催化下變為有色物質，最后通過定性或定量分析有色產物量即可確定樣品中被測物質量。
此方法具有高度的敏感性和特異性，酶標試劑比較穩定，且易于自動化，因此應用非常廣泛，幾乎所有的可溶性抗原抗體系統均可使用，我室開展的肝炎病原學檢測、HIV抗體檢測、梅毒抗體檢測等都使用ELISA方法。
ELISA質量保證是一個復雜的過程，許多重要的環節都影響到檢測的質量。
一、方法學的影響
ELISA測定模式包括以下幾種：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競爭抑制法，其中競爭抑制法（HBeAb,HBcAb等采用）因受操作時差所引起的不公平競爭等因素的影響，結果重復性較差，質量較難控制。
二、試劑因素
不同批次的ELISA試劑在制作過程中很難保證質量完全一致，即使是通過批批檢的項目其檢測結果也存在差異，因此必須選擇和訂購長批號的試劑，并保證保存條件。嚴格執行這一標準可以避免因試劑批號改變而重新建立質控體系及重新評估試劑的復雜過程，并且能夠保證結果的穩定性；對于效期短、使用率低的試劑，應當小量分裝，每次使用則取分裝部分即可，避免反復凍融造成試劑的失效。
試劑使用前必須平衡至室溫，否則會影響檢測下限。未用完的室內質控品及本次不需使用的試劑應密封并及時放回冰箱保存。
三、樣本因素
標本干擾因素包括內源性干擾因素和外源性干擾因素，前者包括類風濕因子、補體、異嗜性抗體、自身抗體、溶菌酶等，后者包括標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存時間過長、標本凝固不全、冷凍標本的反復凍融等。其中外源性干擾因素是我們在檢測過程中可以避免也是必須避免的因素，而避免內源性因素的干擾則主要通過選擇合適的試劑盒。在臨床中遇到少見的疑難病例時應當考慮到內源性干擾因素的存在。以下對外源性干擾因素進行簡要說明：
1.標本溶血 要注意避免出現嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其具有類過氧化物的活性，因此，在以辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）為標記酶的ELISA測定中，如果血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的底物反應顯色。
2.標本被細菌污染 標本的采集及血清分離要注意盡量避免細菌污染。細菌菌體中除可能含有內源酶對測定產生非特異性干擾外，還可能對抗原抗體等蛋白產生分解作用。另外標本在保存中出現渾濁或絮狀物時，應離心沉淀后取上清檢測。
3.標本貯存時間過長 標本在低溫下保存時間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測定中會導致本底加深、甚至出現假陽性結果。通常情況下血清標本可在2～8℃下保存l周，冷凍保存時間會更長，但對于抗體或抗原含量低的標本而言，則可能會因抗體掉價、抗原分解而出現假陰性結果。
4.標本凝固不全 血液通常在采集后半小時后開始凝固，18～24h完全凝固。如果在血液未凝固時即離心分離血清，則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結果。為了縮短標本處理時間，可以在離心前將血液標本置于溫箱中溫育或者采用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當的促凝劑以加速血清的分離。
5.冷凍保存標本避免反復凍融 標本的反復凍融會因其所產生的機械剪切力對標本中的蛋白等分子產生破壞作用，使抗體效價跌落從而引起假陰性結果，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝凍存。此外，標本在凍存時會因蛋白質局部濃縮，分布不均，因此重新融解的標本必須混勻，但不要進行劇烈振蕩，反復顛倒即可。
四、操作因素對ELISA結果的影響
ELISA操作步驟復雜，操作不當將引起較大的誤差。以下敘述各個步驟中的影響因素。
1.加樣
加樣器是一種比較精密的工具，其在長時間使用時會因機械磨損或者推動桿內附著血痂等原因造成加樣不準，尤其是對于樣本量較大的臨床實驗室，因此必須定期對加液器進行維護和校準。
每次加不同的標本時均需更換吸嘴，以免發生交叉污染。
加樣時速度不可太快，避免將標本加在孔壁上部 ，并注意不要濺出或產生氣泡，產生氣泡可以減少標本與包被物的接觸，降低試劑的敏感性。不要讓吸頭接觸孔底部，以防破壞包被物，吸附血清內的蛋白，造成假陽性。
加樣時還應當注意操作時差對結果的影響，操作時差是指加入標本、試劑及混勻時間的差異。操作時差在每個實驗中都存在，尤其是手工操作，日常檢測標本多達幾百個，從加入第一個標本到最后一個標本，需幾十分鐘，加入試劑及混勻等均存在著前后的時間差異，使抗原抗體反應和酶促反應時間不一致，操作時差對競爭法檢測的結果影響更大，在加酶結合物和底物時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。如果使用滴瓶除注意滴加的角度外還要注意滴加的速度，速度太快，容易出現重復滴加或者加在兩孔之間，造成非特異性吸附。另外有些項目在檢測前需要稀釋以減低非特異性反應，但稀釋的方式非常重要，如果采用手工稀釋則容易因操作者個體差異而產生不一致的結果，尤其是吸光度處于臨界值附近的標本，因此最佳的方式是采用振蕩器混勻。
2.溫育
在 ELISA檢測中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫 育(incubation)。
溫育常采用的溫度有 43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的溫育溫度，也是大多數抗原抗體結合的最適反應溫度。有實驗表明，抗原抗體反應一般在37℃經1～2小時產物的生成可達頂峰。為加速反應，可在一定范圍內提高反應的溫度并在反應過程中連續振蕩以增加抗原抗體接觸的機會。抗原抗體反應在4℃反應更為徹底，形成的產物更多更穩定，但因所需時間太長，在ELISA檢測中一般不予采用。
溫育的方式有溫箱法、微波輻射法、水浴法等，其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結果的吸光度差異（這種現象被稱為“邊緣效應”）。若用溫箱溫育則ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。采用這種溫育方式的關鍵是必須保證濕盒內的溫度達到反應的要求，可在反應前將濕盒預溫至規定的溫度，并用溫度計監測反應過程。采用水浴時，將ELISA板置于水浴箱中，板底貼著水面。為避免蒸發，板上應加蓋或用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。溫育過程中，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。嚴謹的ELISA試劑盒一般都規定了明確的溫育溫度，若要求室溫溫育，則一般是指20～25℃。微波輻射法能縮短溫育時間，但不能解決“邊緣效應”，因而較少使用。
3.洗滌
洗滌是ELISA測定過程中決定實驗成敗的一個關鍵步驟。其目的是去除反應體系中與反應無關的成分、未結合的酶結合物以及反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。由于抗原和抗體的包被通常是在堿性條件下與固相的疏水鍵相互作用而被動吸附于其上的，因此必須注意非離子去垢劑的使用濃度，最常用的洗滌液是含0.05％吐溫20的0.02mol/L， pH 為7.4的 PBS液，如果洗滌液中的吐溫20超過 0.2％，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響實驗的測定下限。
洗滌可采用洗板機或手工洗滌兩種方式，手工洗板則分為浸泡式和流水沖洗式洗滌。無論洗板方式如何，在向板孔內注液時應當避免氣泡殘留孔內，否則會因洗滌液難以進入孔中而影響洗滌效果。在采用洗板機洗板時，一定要將板條平放于板架上，保證洗板機上的每個吸液針都能一致地插入板孔底部將洗液完全吸凈，否則空白值將升高甚至出現“花板”現象（背景不干凈），造成實驗失敗，尤其是當酶結合物非特異吸附而殘留于板孔時。若采用手工洗板，則可在每次棄去板孔內液體后將反應板于布料上拍干，布料可在消毒洗滌后重復使用。
手工洗板一般為3～5次，使用洗板機洗板時，其所需次數可通過以下實驗確定：選擇8×12 HBsAg ELISA包被板條，在每孔中平行加入相同的一份弱陽性血清，按試劑盒說明加入酶結合物并完成溫育，洗板機設置如下：第1次洗滌1排、第2次洗滌2排、第3次洗滌3排……直至8次洗滌8排，每次只洗滌1遍，其結果是第1排洗滌了8遍，第2排洗滌7遍……第8排洗滌1遍，加底物顯色后，根據吸光度值不再改變的反應條的洗滌次數來確定最佳的洗板次數，例如第3排反應條吸光度值不再改變，則認為該項目最佳洗滌條件為6遍。另外有三方面必須注意：一是在使用洗板機洗板時，通常在上機前應先將反應液棄去并用流水快速沖洗1遍，避免因反應液對洗板機管道污染而造成的交叉污染和背景顏色加深，但對于粘性大的稀釋液或反應液而言，則需直接上機洗滌，并增加洗板后清水沖洗管路的次數；二是對于兩步法而言第一步洗滌次數不宜太多，否則將降低結果的吸光度值。
4.顯色
顯色是 ELISA中的最后一步溫育反應，在以HRP作為標記酶的ELISA試劑盒中，主要采用TMB和OPD兩種底物，其中以TMB最為多見，TMB底物顯色一般要求室溫或37℃反應15～30分鐘。研究表明，顯色受時間和溫度的影響，一般37℃反應30分鐘可使顯色充分，如果縮短反應時間或者降低反應溫度均可影響檢測的下限。為了保證結果的穩定性，必須固定顯色時間和溫度，但不少操作者往往忽略了這一點。TMB顯色體系的A液和B液可在使用前先混合然后用排槍加入反應孔中，這樣既節省人力又縮短了操作時差對結果的影響。反應液應新鮮配制并且避免接觸金屬器皿，否則可因氧化等原因產生顏色反應。OPD由于其具有致癌性目前已很少使用。
5.比色
ELISA顯色的結果必須通過酶標儀進行檢測，有兩個重要的原因：一是不同的個體的色覺存在差異，如果僅憑肉眼判斷，則結果重復性差，并且難以形成統一的判斷標準，尤其是對于HBeAb、HBcAb這樣的檢測項目；二是日益頻繁的醫療糾紛要求臨床實驗室必須對ELISA檢測的原始吸光度值，陰陽性判斷結果等原始數據進行保存，否則面對醫療糾紛時將無法舉證。
TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止，各類酸性終止液則將藍色轉變成黃色。有實驗表明，從終止反應后2分鐘開始，樣本的吸光度值逐漸下降，起始吸光度值越高其下降速度越快，為保證實驗結果的穩定性，宜在終止反應后2分鐘內讀取吸光度值。
酶標儀應采用雙波長進行測定，必須包括對顏色產物敏感和不敏感的兩個吸收峰波長，在非敏感波長處測定特異性顯色的吸光度值接近為零，此時測的吸光度值為容器上的劃痕、指印、背景等造成的光干擾。以TMB底物為例，其最大吸收的波長為450nm，非敏感波長為630nm，雙波長檢測最終得到的吸光度值為兩者之差。雙波長測定能去除背景的干擾，一般不設空白孔，否則會出現吸光度值為負值的現象。
酶標儀的使用需強調儀器的維護和保養，酶標儀首先應放置通風處，避免機器內部尤其是濾光片發霉，在使用過程中避免酸等物質溢出腐蝕儀器，每半年或一年請計量局對酶標儀進行檢定，并請廠商定期維護。比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體。酶標儀在使用前應先預熱15～30分鐘，測讀結果會更穩定。
五、灰區的設置
通常情況下，ELISA定性實驗以“陽性”和“陰性”來報告結果，兩者間有一條分界線被稱為“陽性判斷值”（cut-off value，CO值），這是定性免疫測定結果報告的依據。由于ELISA CO值的設置不能區分所有正常和異常的人群，尤其是位于CO值附近的人群，并且ELISA檢測具有以下幾個特點：檢測變異大（18%～65%）；不同試劑盒CO值存在差異；病毒感染存在窗口期；病毒變異后表達產物含量低以及個體差異等，因此在CO值附近存在一個臨床意義可疑的的區域被稱之為“灰區”，在國內的傳染性病原體抗原和抗體檢測的ELISA試劑盒中均未涉及“灰區”的設置，但僅僅依靠CO值來決定感染的有無，尤其是對獻血員的篩查具有較大的風險。因此對于檢測結果位于“灰區”的病人可采用確認實驗或追蹤檢測的辦法加以確診。
目前“灰區”的設置有二種方式：⑴CO×（1±CV）， CV為該試劑的批內CV (一般在15-20%)；⑵CO±2s，s為實驗室做室內質控ROC（常規條件下的變異）的標準差。
六、標本復查
ELISA手工檢測過程復雜，影響因素較多，即使室內質控在控，也可能因孔間差異而造成結果的差異，因此加大復查力度是保證結果準確性的可靠方法，比如對HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等項目的可疑、弱陽性標本及少見模式的檢測結果進行復查。
復查方式主要有三種：一是采用同一種試劑復查，理由是市售試劑均通過國家食品藥品監督管理局（SFDA）認可，嚴格按照其說明書操作，檢測結果具有法律效應，若使用不同的試劑（非確證試驗）復查，當結果不相符合時，則最終結果難以判斷（免疫檢測缺乏“金標準”）。第二種復查方式是采用同一種方法的不同廠家的試劑進行復查，由于不同廠家包被的抗原或抗體不同，其檢測重點針對的亞型也有不同，敏感性和特異性也稍有差異，故采用不同廠家的試劑比用同一種試劑復查更好一些。三是采用不同方法不同廠家的試劑，可以彌補方法學上的缺陷。
七、結果判斷和報告
常用下列幾種方法表示結果：
1.定性測定
(1)陽性判定值法(cut-off value，CO)：一般為陰性對照的平均A值加一個常數，試劑制備、檢測過程必須嚴格標準化，要先計算出陽性對照A值平均數和陰性對照A值平均數。標本A值≥陽性判定值為陽性。陽性判定值公式中的常數是在特定的檢測系統中通過對大量標本的實驗檢測而得到的。現以HIV檢測試劑盒為例。NC=陰性質控對照的A值；PC1=抗-HIV-1陽性質控對照的A值；PC2=抗-HIV-2陽性質控對照的A值；NC值的要求：⑴NC必須小于0.250。去掉大于等于0.250的陰性質控對照。⑵計算留下的陰性質控對照的平均值（NCx）。⑶NC必須在0.6NCx和1.4NCx之間。去掉NC小于0.6NCx和大于1.4NCx的陰性質控對照。實驗滿足下列條件有效：⑴多于半數的陰性質控對照符合要求（一般為1個PC，3個NC）；⑵PC1-NCx≥0.400；⑶PC2-NCx≥0.400(如果使用)。如果實驗有效，CO=NCx+0.100,樣品A值大于等于CO，判定為有活性反應。樣品A值小于CO，判定為無活性反應。根據以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到了質控的作用，試劑變質和操作不當均會產生“實驗無效”的后果。由此可以看出為了避免檢測結果受單孔陽性或者陰性對照的影響（當參與CO計算時），必須設立多孔對照、合理布局，并限定取舍條件。
(2)S/C（待測標本A值／校準品A值）：S/C≥1.1為陽性，S/C＜0.8為陰性；S/C≥0.8但＜1.1為可疑，反應體系中陽性、陰性對照及校準品檢測的吸光度必須落在規定的范圍內，結果才有效。
(3)S/N值法(待測標本A值／陰性對照A值)或S／Co值法：通常S／N≥2．1 ，S／Co≥1為陽性。
(4)抑制率法：在競爭抑制法中結果可用抑制率表示。抑制率（％）＝（陰性對照A值-標本A值）/陰性對照A值×100%，一般以抑制率≥50%為陽性。
2.半定量測定 結果一般以滴度表示。將標本連續稀釋后，進行ELISA檢測，在陽性臨界值以上的最高稀釋度即為該標本的“滴度”。
3.定量測定 即用已知量的標準品作一系列稀釋后進行ELISA測定，繪制標準曲線，結果以絕對量或單位表示。在ELISA定量檢測中每一塊反應板都必須繪制相應的標準曲線。
4.結果報告
傳統的ELISA結果只報告“陽性”或者“陰性”，但不能解決“灰區”的問題，因此引入“可疑”的報告方式是比較合理和科學的，同時對結果做必要的說明，如“結果已經復查，建議定期復查或定量檢測”；對于HBeAb、HBcAb檢測，由于各試劑盒CO值差異及變異系數大等因素，結果缺乏可比性，位于CO值附近的標本復查結果陰陽性只是概率事件，另外HBcAb存在原倍和1：30檢測模式及定量檢測模式，報告結果的不一致對于臨床實驗室來說是不可回避，也是目前醫療糾紛主要集中點和“結果互認”的最大障礙，因此在減小室內變異的同時必須引入陽性和弱陽性的報告方式。
八、質量控制
1.室內質量控制（室內質控）
ELISA定性試驗的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關，因此質量控制（quality control, QC）要保證試驗的靈敏度和重復性。目前定性實驗的質控規則還還存在爭議，目前有以下幾種比較流行的理論：
⑴室內質控品
室內質控品的穩定以及合適的濃度是運用一切質控規則的前提。可選擇S/CO值減去精密度測定中得到的三倍批間CV%（通常的ELISA測定批間變異（CV%）在15%左右）與該S/CO值的乘積（意即三倍SD）仍大于1的質控血清作監測重復性的室內質控品用。 計算公式：S/CO（1-3CV%）=S/CO-3SD。同時選擇S/CO處于1.5左右的質控血清以判斷每次測定時試劑盒測定下限的有效性。
⑵ “即刻性”質控
一些實驗室不是每天進行ELISA項目的檢驗，而ELSIA部分試劑盒效期短 ，用同一批號試劑盒連續常規測20次，難度較大。采用"即刻法"質控統計方法，只需連續測3次，即可對第3次檢驗結果進行質控。①先將測定值從小到大排列，X1最小，Xn最大 ；②計算X和s；③計算SI上限值和下限值。SI上=（X最小-X）/S，SI下=（X最大-X）/S；④對照SI表，檢查是否出控。SI上、下限≤規定值，在控； SI上或下限>規定值，失控。
⑶Levey-Jennings質控圖結合Westgard多規則質控方法
Levey-Jennings質控圖以及Westgard多規則質控方法最早應用于生化檢測的質量控制，在ELISA檢測中仍為探索階段，一般認為：①一 次超出3SD；②連續二次超出2SD；③3～5次連續處于一側的2SD之內；④5～7次連續偏向橫軸的一側，均為失控。目前多采用一次超過2SD作為“告警”，一次超出3SD為“失控”。
另外還有Westgard多規則質控規則、累積和（CUSUM）質控規則等質控方法。
⑷衛生部臨床檢驗中心確定的質控方法：
室內質控品：定性測定的室內質控品，除了試劑盒附帶的陰陽性對照外，實驗室還應該選擇至少2個室內質控品，其中一個為弱陽性質控品，接近Cutoff值，S/Co值應該為2～4之間；另一個為陰性質控品。定量測定則至少要求一個水平的質控品。
測定頻度：每臺儀器，每次檢測患者樣本時至少測定一次室內質控品；ELISA測定每塊板都要測定室內質控品。
質控圖繪制：定性測定可采用弱陽性質控品的S/Co值作質控圖。定量測定參照臨床化學的繪制方法。質控判斷規則：定性測定為弱陽性的質控品不能測定為陰性；陰性質控品不能測定為陽性。重復性的判斷規則為12S（警告限），13S為失控限。定量測定參照臨床化學的判斷規則。
⑸室內質控的現狀及應對措施
免疫質控品制作困難，不管是自制血清或者購于其它機構，其穩定性和濃度很難達到要求，加之ELISA影響因素較多，失控后很難找到確切的原因。因此如何開展ELISA室內質控一直困擾著臨床檢測者。基于此，不同實驗室采取了不同的應對措施，舉例如下：①選擇衛生部臨床檢驗中心（NCCL）的低值質控血清作為室內質控品，儲備量以3個月，采用一次超過2SD作為“告警”，一次超出3SD為“失控”的質控規則，（但該法對于HBeAb（4NCU/ml）、 HBcAb(2NCU/ml)檢測不適用，因為即使質控在控，其結果也可能為陰性）；②由于質控品不穩定，每個月需重新設立靶值 ，并根據常規CV設定SD（SD= ×CV¯）；③陰陽性對照正常，室內弱陽性和陰性質控正常，且沒有出現“花板”（洗板不干凈，背景顏色深）的情況下認為該檢測批有效，但仍需對位于“灰區”和弱陽性的HBsAg、HBeAg結果及少見模式結果進行復查，避免偶然因素及孔間差對結果造成影響；④若陰陽性對照、陰性質控異常，或出現“花板”的情況則必須整批復查；⑤在陰陽性對照、陰性質控正常且未出現“花板”的情況下，弱陽性質控S/Co超出-3SD時復查位于“灰區”標本，超出+3SD時則復查弱陽性標本；⑥對于抗體檢測，尤其是競爭法檢測HBeAb、HbcAb，由于不同試劑盒、不同檢測方法間CO值存在差異及變異系數大等因素，結果缺乏可比性，失控后的處理很難滿意地解決，在沒有統一的判斷標準、較小的變異系數及明確的臨床意義的情況下，引入弱陽性報告方式在臨床實踐中證明可行；⑦室內質控的評價：認真分析每一次室內質控失控的原因，并對各項檢測的均值，CV等進行月與月之間的比較分析，及時發現試劑盒檢出能力的變化及操作中存在的問題，并采取適當的措施來提高檢測的精準性。
2.室間質量評價（室間質評）
室間質評是一種回顧性評價，主要是控制實驗結果的準確性，也是某些定量實驗量值的溯源。作為臨床實驗室應當積極參與各級室間質評計劃，其要點是保證同病人標本一樣對待室間質評物。必須強調的是室間質量評價結果必須同室內質控一并分析，查找原因以期改進工作中的不足，同時指導實驗室選擇合適的試劑盒。
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