循環microRNA與腫瘤診斷

鐵軼, 付漢江, 鄭曉飛*

軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所, 北京 100850

* 聯系人, E-mail: xfzheng100@126.com

收稿日期: 2008-09-22; 接受日期: 2008-11-28

國家自然科學基金(批準號: 30870529和30873008)和“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”重大科技專項(批準號: 2008ZX10002-016)資助項目

摘要 miRNA是一類小分子調控RNA, 在腫瘤的發生與控制方面發揮著重要的作用. 已經發現在腫瘤患者的循環核酸中存在源自腫瘤的miRNA分子, 這一現象提示循環miRNA分子可能成為無創診斷癌癥的一個有效的方法. 本文綜述了循環miRNA作為循環生物標志物在腫瘤診斷中的應用, 以及該領域的最新研究進展.

關鍵詞 循環miRNA 腫瘤 診斷

  

半個多世紀前, Mandel和Metais[1]發現血漿和血清中存在循環核酸(circulating nucleic acids, CNAs). 循環核酸屬于細胞外核酸(extracellular nucleic acids, ENAs), 細胞外核酸按照種類可以分為DNA和RNA. 其中細胞外RNA按照其所處位置可以分為細胞膜結合RNA(cell bound RNA)、循環RNA (circulating RNA)和細胞外基質RNA(RNA in the extracellularmatrix). 研究揭示, 正常人血漿內存在RNA, 細胞外普遍存在RNA[2]. 從發現循環核酸開始, 人們就一直致力于循環核酸用于臨床疾病的無創診斷預警方面的應用研究中. 隨著檢測技術方法的不斷進步, 對于循環核酸在疾病診斷中的應用研究有了實質性的進展, 在循環RNA作為腫瘤診斷和預后、器官移植監測、急性疾病診斷、產前遺傳疾病的診斷等領域都取得了一些重要成果[3,4]. 對腫瘤的研究發現, 患者血漿中RNA的含量明顯增加. 瘤細胞基因表達模式與正常組織有明顯的不同, 可以通過檢測腫瘤病人循環RNA中的腫瘤特異的mRNA來進行腫瘤的診斷, 因此血漿RNA分子用作癌癥的診斷標志分子顯示了良好的應用前景[5,6]. 近年來新發現的microRNA (miRNA)與腫瘤的發生和發展有著極為密切的關系. 基于miRNA 在腫瘤中的表達往往是失調的, 且具有組織特異性, miRNA在血液中有異常高的穩定性這些事實, 研究者推測miRNA可能是一個理想的基于血液的腫瘤檢測生物標志物. 最近在這一應用研究領域取得了重要進展, 本文將對此給予介紹.

1 miRNA與腫瘤

miRNA是一類長約19~24 nt的非編碼單鏈小RNA分子, 在動物中, 絕大多數miRNA可以通過與靶基因3′UTR區互補結合, 抑制靶基因翻譯成蛋白質, 進而在細胞、組織或個體水平上影響生物體的生長發育, 并參與多種疾病過程[7,8]. 一系列的研究表明miRNA在細胞生長和凋亡、血細胞分化、同源異形盒基因調節、神經元的極性、胰島素分泌、大腦形態形成、心臟發生、胚胎發育和脂肪代謝等過程中發揮重要作用. 雖然對已發現的miRNA分子的功能和作用靶基因了解的還很少, 但是對miRNA在不同組織和疾病中的表達譜分析發現, miRNA的表達譜具有明顯的組織特異性, 在一些疾病中miRNA的表達譜改變具有明顯的特征, 尤其是在腫瘤疾病中. 正

常組織和腫瘤組織中miRNA表達明顯改變. miRNA在不同腫瘤中具有特定的表達模式. miRNA在腫瘤中表達的這些特點在肝癌、肺癌、腸癌、卵巢癌和白血病等多種惡性腫瘤中得到了證實[9]. 這些特點也使miRNA有可能成為腫瘤診斷的新的生物學標記和治療藥物作用的靶標. 鑒于血清中循環RNA在腫瘤診斷和預后應用研究中取得了重要進展, 國內外的多家實驗室開展了循環miRNA作為腫瘤無創診斷生物學標志物的研究, 并取得了重要成果.

2 循環miRNA的存在

目前已經發現并被miRBase數據庫[10]收錄的人類miRNA分子有695種. 其中絕大部分的miRNA分子在不同病理和生理狀況下進行表達, 并且多數miRNA能夠在人體液中檢出. Chen等人[11]應用Solexa測序技術對正常的中國人血清miRNA進行測序分析, 在男性和女性血清中分別發現了100種和91種miRNA分子. Taylor和Gercel-Taylor[12]分析了來自同一卵巢癌患者的癌細胞和分離自血清的外來體(exosome)中的miRNA, 在被分析的467種miRNA中有218種呈陽性. Mitchell等人[13]為了證實人體血漿中是否存在miRNA分子, 分離了健康人血漿中的18~24 nt的RNA, 構建了小RNA文庫, 對得到的125個DNA克隆進行測序分析, 在所采用的血漿樣本中克隆到了37種miRNA分子, 其中包括let-7a, miR-16和miR-15b等. 對其中克隆到的中等豐度的miR-16和miR-24, 低豐度的miR-15b采用qRT-PCR方法進行檢測, 在3位正常人血漿中3種miRNA分子表達量在每微升血漿8,910~133,970拷貝之間. 已有的對正常人和不同疾病人血清和血漿中miRNA檢測結果表明, miRNA分子同已知的循環核酸(DNA和RNA)一樣, 廣泛存在于正常人和不同種病人的血清和血漿中, 并且隨著生理狀況、疾病的種類和病程的不同, miRNA分子在血清和血漿中存在的種類和數量將發生變化. 循環miRNA在體液中的存在量雖然高低不同, 但是完全可以采用基因擴增技術進行檢測. 這一事實為循環miRNA作為疾病無創診斷和預后的生物標志物提供了潛在的可能.

循環miRNA是如何產生的？其生物學功能又是什么？一系列的問題還有待闡明. 對于循環miRNA的來源目前主要觀點有: 循環RNA來自于凋亡或壞死的細胞, 細胞的主動釋放, 以及循環細胞的裂解. 但對于特定循環miRNA的真實來源還存在許多未知的因素. 研究表明, 內源循環miRNA分子多數不是以游離形式存在的, 常與蛋白等構成顆粒存在, 因而內源性的循環RNA分子具有良好的抗RNase降解能力, 有較高的穩定性. 這一特點也為循環RNA發揮生物學功能提供了前提保證. Benner[14,15]早在1988年就曾提出“細胞外通訊RNA(extracellular communication RNA)”假說, 并認為細胞外RNA在細胞增殖和分化中起重要作用. Valadi等人[16]最近在研究人和小鼠的肥大細胞系(HMC-1和MC/9)外來體時發現其中存在mRNA和miRNA分子, 體外翻譯證明外來體mRNA是有功能的. 實驗還發現外來體RNA可以實現在細胞間的轉移, 小鼠外來體mRNA轉移到人肥大細胞中后, 在受體人細胞中可已檢測到鼠蛋白的表達, 這表明外來體mRNA和miRNA可以從一個細胞轉移到另外的細胞中, 并且在新的細胞中發揮功能. Valadi等人將這種RNA命名為外來體穿梭RNA(exosomal shuttle RNA, esRNA). 已有的部分研究結果已經充分說明細胞外的循環RNA分子并不是“垃圾RNA”(junk RNA), 循環RNA可能在生物體中具有重要的生物學功能. 對細胞外RNA的了解, 將豐富對RNA生物學功能的認識, 這對全面闡釋生命的本質, 提高人類的健康水平具有重要意義.

3 循環miRNA檢測方法

RNA分子易于降解, 循環RNA的含量一般較低, 在一定程度上限制了體液中RNA分子作為生物標志物的應用. 但是, 最近研究結果表明循環miRNA在血清和血漿中通常是與蛋白質結合在一起, 具有良好的穩定性. 這就為循環miRNA作為生物標記物進行檢測提供了可能. 目前已經發展了多種有效的miRNA檢測方法, 根據研究目的和樣品來源的不同可以選擇最適合的檢測方法. 對于發現新的miRNA分子, 克隆測序仍是首選方法[17,18]. Northern blot是驗證和確認miRNA的重要方法, 但該方法繁瑣并且靈敏度較低, 不適用于臨床樣本的高通量檢測[19]. RT-PCR方法是檢測miRNA表達的一種常用方法, 實時定量PCR(quantitative real-time PCR)可以很精確地定量分析miRNA的表達. 基于PCR原理的miRNA檢測方法有多種, 常用的有基于莖-環的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)[20], 基于polyA加尾的RT-PCR方法[21], 以及其他類似的方法. 實時定量PCR是循環miRNA定量檢測最常用的有效方法. 另外芯片技術(microarray)檢測方法可以實現快速、高通量的檢測[22]. 目前已有多種類型的miRNA檢測芯片可以選用. 但是基因芯片檢測方法的重現性和準確性比較差, 一般多用于初篩, 對獲得的結果通常需要采用Northern blot和實時定量PCR進行驗證. 最近, Driskell等人[23]建立了表面增強拉曼光譜法(surface- enhanced Raman spectroscopy, SERS)用于miRNA檢測和分類. Kato[24]建立了一種新的采用熒光DNA探針檢測成熟miRNA的技術. 目前miRNA檢測限已經可以達到fM水平. 隨著研究的深入, miRNA檢測方法將會不斷完善和規范化, 最終將建立一套高靈敏度、高精確度的循環miRNA檢測方法.

循環miRNA檢測過程中, 樣品的處理和RNA制備十分重要. Mitchell等人[13]采用EDTA作為血液抗凝劑, 血清和血漿miRNA提取采用mirVana PARIS試劑盒, 與常規提取RNA所不同的是, 用等體積酸性酚-氯仿抽提樣品兩次以更好地去除蛋白成分. Chen等人[11]采用Trizol方法提取血清中的miRNA分子, 為了去除血清中的蛋白, 也增加了酚-氯仿抽提步驟. Gilad等人[25]采用了不同方法制備血清miRNA, 首先用蛋白酶K消化血清, 然后用酸性酚-氯仿抽提, 乙醇沉淀, 水溶解, DNase消化, 再次用酸性酚-氯仿抽提.

Mitchell等人[13]的檢測結果表明血漿室溫放置24 h, 或經過8次凍融, 采用基于莖-環的RT-PCR方法檢測, 內源miRNA的量沒有明顯變化, 證明血漿中的內源miRNA分子是穩定的. 采用基于莖-環的RT-PCR方法, 即使不提取血清中的miRNA, 直接以血清為模板也能夠檢測到miRNA分子. 對不同極端條件下血清miRNA穩定性研究表明, 經過多次凍融, 極端pH(pH 1和pH 13)處理3 h, 血清miRNA仍有極好的穩定性. Gilad等人[25]對miRNA檢測采用的方法是首先進行polyA加尾, 然后用帶有錨定引物的oligodT進行反轉錄, 之后進行PCR反應, 用探針進行檢測, 同樣獲得了良好的結果. 檢測結果表明解凍的血清室溫放置4 h對不同miRNA的量沒有明顯的改變, 但血清經過兩次凍融會稍有影響, 但是不影響血清miRNA作為生物標志物的檢測. 在血漿和血清中, 同一種miRNA的檢測結果具有極好的相關性, 說明血清和血漿miRNA都適合用于生物標記檢測.

上述研究結果表明, 血清中的miRNA分子有良好的穩定性, 采用常規RNA提取方法就可以獲得滿足實驗要求的miRNA. 對于血清中miRNA分子的檢測, 實時定量PCR是最適用和有效的方法. 這些便利條件為臨床大規模檢測奠定了基礎. 今后需要建立和形成一套標準化的血液樣本采集、運輸保存、RNA提取制備和實時定量PCR檢測技術體系, 以及數據處理系統, 確保miRNA檢測結果標準化.

4 循環miRNA在腫瘤檢測中的應用

理想的循環miRNA標志物是在腫瘤細胞中等或高水平表達, 在健康人血漿中檢測不到或低水平存在. Mitchell等人[13]為了驗證血清中是否存在來自腫瘤的循環miRNA分子, 設計了一個精巧的實驗, 將人前列腺癌細胞22Rv1接種到NOD/SCID免疫缺陷小鼠體內, 在接種癌細胞的小鼠血漿中檢測到了源自人腫瘤細胞, 而在小鼠中沒有同源基因的miR- 629*和miR-660, 并且miR-629*和miR-660豐度與移植瘤小鼠腫瘤的大小有一定的相關性. 這一實驗結果表明源自腫瘤的miRNA能夠進入血液循環, 循環miRNA的量一定程度可以反映腫瘤的大小. 隨后, 選擇了miR-100, miR-125b, miR-141, miR-143, miR- 205和miR-296作為人前列腺癌候選標志物, 并進行了深入研究. 對25個轉移性前列腺癌和25個健康人血清進行分組檢測, 結果miR-141在前列腺癌患者血漿中含量明顯高于對照組, 并且與前列腺特異抗原(prostate-specific antigen, PSA)水平有一定的相關性. 上述結果表明, miR-141可以成為檢測前列腺癌的循環miRNA標志物.

Chen等人[11]采用Solexa測序方法對健康人血清、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和腸癌(colorectal cancer, CCS)患者血清中的小RNA分子進行測序分析. 與對照血清相比, 肺癌血清miRNA譜明顯不同, 28種正常血清中存在的miRNA沒有檢出, 但是新檢測出了63種在正常血清中沒有的miRNA分子. 而且肺癌血清miRNA譜與肺癌血細胞(lung cancer blood cell, LCC)miRNA譜也存在明顯的差別, 有57種miRNA在肺癌血清和肺癌血細胞中共有, 但有76種miRNA僅在肺癌血清中檢出. 這一點與健康人也不同, 健康人血清和血細胞的miRNA譜基本相同. 隨后對差別最大的miR-25和miR-223進行了驗證, 檢測了152例肺癌血清和75例健康人血清, miR-25和miR-223在肺癌患者血清中高表達得到了驗證. Chen等人[11]采用同樣的方法分析了腸癌血清miRNA, 結果在腸癌血清中檢測出了69個正常血清中沒有的miRNA. 但是卻發現腸癌血清與肺癌血清中的miRNA有相當數量的重疊, 這提示癌癥患者血清中可能存在共同的miRNA分子.

卵巢癌的早期診斷對于提高生存率十分重要, 但是大多數患者被確診時已進入晚期. Taylor和Gercel-Taylor[12]對卵巢癌腫瘤釋放到血液中的外來體中的miRNA進行了檢測, miR-21, miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-200b, miR-203, miR-205和miR-214等8種miRNA在卵巢癌細胞和外來體中水平相當, 而來自良性卵巢疾病和卵巢癌患者的EpCAM陽性的外來體中miRNA譜明顯不同. 這一結果表明, 循環腫瘤外來體中miRNA譜可能用于卵巢癌的篩查.

5 循環miRNA與其他臨床診斷

Chen等人[11]還采用Solexa測序方法對糖尿病(diabetes)患者血清中的小分子RNA進行測序分析. 糖尿病患者血清miRNA譜與正常血清相比也有明顯的不同, 雖然沒有腫瘤血清與正常血清的差別大. 有意思的是, 糖尿病血清與肺癌血清共有大量正常血清中沒有的miRNA. 糖尿病血清與糖尿病血細胞共有84種相同的miRNA, 它們分別獨有17和27種miRNA. 泊松相關散點圖顯示, 血清miRNA改變比血細胞miRNA改變能更敏感地反映糖尿病患者的病情.

對于循環miRNA與腫瘤及其他疾病的關系研究尚處于起步階段, 但現有研究結果已為疾病的無創診斷研究開辟了一條新的道路.

Gilad等人[25]采用實時定量PCR方法檢測了10名非孕婦、10名妊娠早期和10名妊娠晚期孕婦血清miRNA譜, 共檢測了28種miRNA分子, 其中包括在胎盤中表達的miRNA. 結果所有胎盤表達miRNA在孕婦血清中高表達. 其中血清中miR-526a和miR- 527水平在妊娠晚期顯著上升. 研究發現, 胎盤miR- 526a, miR-527和miR-520d-5p可以用來準確地辨別是否妊娠. 可見, 循環miRNA還可以反映特定的生理化。

對于循環miRNA與腫瘤及其他疾病的關系研究尚處于起步階段, 但現有研究結果已為疾病的無創診斷研究開辟了一條新的道路.

6 展望

miRNA分子廣泛參與基因表達調控、生物應激和非生物應激反應. miRNA分子不僅自身作為功能分子發揮作用, 還廣泛參與和決定基因表達調控和蛋白質翻譯, 進而影響細胞的新陳代謝等所有生命過程. miRNA標志物將成為疾病發生發展相關基因標志物、蛋白質標志物和代謝物標志物整體“網絡”中的“結點”, 可以實現從蛋白質、DNA和RNA三大生物分子方面對腫瘤的發生和發展進行預警和預后. 因此, 循環miRNA分子標志物, 將改變和補充對腫瘤發生發展的傳統認識, 整合血清基因組、蛋白質組、多肽組和代謝組等研究結果發現的腫瘤生物標志物, 將全方位認識腫瘤發生和發展的分子機制, 有可能提供腫瘤診斷和治療的組合生物標志物. 隨著循環miRNA檢測方法的標準化, 以及對循環miRNA的生成機制、生物學功能和與相關腫瘤的關系的逐步闡明, 可以相信循環miRNA在未來的臨床無創疾病診斷和預后中將展示出廣闊的臨床應用前景.

 

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