lonza 無(wú)血清 培養(yǎng)基
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牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)在分類學(xué)上屬黃病毒科(Flaviviridae)，瘟病毒屬(Pestivirus)成員，與屬內(nèi)的豬瘟病毒(classi—calswinefever virus，CSFV)及羊邊界病毒(borderdiseasevirus，BDV)在血清學(xué)上有交叉反應(yīng)。BVDV感染的牛能引起多種臨床癥狀，如高熱、腹瀉、流涎、停食、白細(xì)胞減少、免疫抑制、黏膜充血等，還能引起奶牛產(chǎn)奶量下降，孕牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及牛的持續(xù)性感染。野生反芻動(dòng)物對(duì)BVDV非常敏感，尤其是鹿科動(dòng)物更易感，在南達(dá)科他東南部的兩頭白尾鹿體內(nèi)檢測(cè)到了BVDV，并且在幼鹿中可持續(xù)感染。E2囊膜糖蛋白是BVDV抗原性的主要決定部分，同時(shí)又是變異率較高的一種結(jié)構(gòu)蛋白，其變異可引起B(yǎng)VDV中和逃逸，導(dǎo)致動(dòng)物持續(xù)感染。BVDV的檢測(cè)方法也很多，Semrau等用熒光定量PCR對(duì)大量的樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從血清樣品中檢測(cè)到BVDV呈陽(yáng)性的樣品數(shù)量比口、鼻分泌物樣品多。酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)具有敏感、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合單抗應(yīng)用具有很大的優(yōu)勢(shì)，抗BVDV單克隆抗體在牛病毒性腹瀉病臨床診斷，特別在研究BVDV抗原基因變異方面起著重要作用。我們?cè)谘芯恐杏肂VDVE2表達(dá)蛋白免疫Balb／c小鼠，研制出5株單抗，并在此基礎(chǔ)上開展了抗原捕獲ELISA(AC-ELISA)的研究工作。
1 材料與方法
1．1 病毒、單抗和陰性腹水
sf9昆蟲細(xì)胞表達(dá)的BVDVE2蛋白來(lái)自軍事獸醫(yī)研究所病毒室，抗BVDV E2蛋白單克隆抗體4G3(ELISA效價(jià)1．8X10 5)自制。陰性腹水自制。
1．2 試驗(yàn)動(dòng)物
1．5—2．0 kg的健康雌性家兔購(gòu)自衛(wèi)生部長(zhǎng)春生物制品所，用于制備多抗。新生小牛購(gòu)自長(zhǎng)春市郊奶牛場(chǎng)，試驗(yàn)前檢測(cè)BVDV為陰性，用于制備陰性小牛血清。
1．3 主要試劑
蛋白A凝膠(ProteinA Sepharose)及抗體純化層析柱購(gòu)自BIOTECH公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)等均購(gòu)自SIGMA公司。細(xì)胞培養(yǎng)基Grace為GIBCOBRL公司的產(chǎn)品；PAGE低分子量蛋白Marker購(gòu)自TAKARA公司；PEG600購(gòu)自上海生物工程有限公司；BCA試劑盒購(gòu)自Pierce公司。
1．4 單抗純化鑒定
將IgM亞型的單抗4G3采用PEG6000純化，純化后的單抗用SDS-PAGE鑒定純度和BCA試劑盒測(cè)定濃度后低溫保存?zhèn)溆谩?
1．5 多抗的制備、純化和濃度測(cè)定
以弗氏完全佐劑(FCA)乳化桿狀病毒表達(dá)并純化的BVDVE2蛋白免疫家兔，分點(diǎn)皮下注射1 000μg／只，共免疫3只。2周后以弗氏不完全佐劑(FIA)乳化蛋白分點(diǎn)皮下注射相同劑量，最后一次免疫，直接用生理鹽水稀釋蛋白皮下注射1 000μg的重組E2蛋白抗原。2周后采血測(cè)抗體效價(jià)。待抗體達(dá)到要求后殺兔采血，分離血清。將兔血清采用蛋白A(Protein A Sepharose)柱層析法純化，純化后的IgG用SDS-PAGE鑒定純度和BCA試劑盒測(cè)定濃度后低溫保存?zhèn)溆谩?
1．6 NP-40處理制備BVDV抗原
將桿狀病毒表達(dá)BVDV E2蛋白的sf9細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，待鋪滿整個(gè)瓶底時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，1 503 g／min離心，收集細(xì)胞上清原液，加人1％細(xì)胞原液量含1％NP-40的PBS緩沖液，室溫旋渦震蕩1．5-2 h，然后601 g／min 4℃離心10min，上清作為被檢陽(yáng)性抗原，用同樣方法處理的sf9細(xì)胞上清作為陰性對(duì)照。
1．7 單抗和多抗最佳使用濃度的篩選
采用方陣滴定法，將純化后的單抗和多抗分別稀釋至20 μg／mL、10μg／mL、5μg／mL、2 μg／mL、1 μg／mL、0．5μg／mL 6個(gè)不同濃度，包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜后，以1％BSA的PBS溶液37℃封閉1 h，用0．15％吐溫-20的PBS洗3次后加入NP-40處理的BVDV細(xì)胞培養(yǎng)抗原，同時(shí)加入同種方法處理的正常細(xì)胞培養(yǎng)物做陰性對(duì)照，37 ℃作用1 h；用含1％明膠的PBS溶液37 ℃封閉1h；加入不同濃度的兔抗BVDVIgG(20、10、5和2μg／mL)，37 ℃作用1 h；洗滌后加入羊抗兔酶標(biāo)抗體(Sigma)，37 ℃作用1 h；再次洗滌后加入新配的底物溶液TMB+H2O2，37 ℃作用15 min；用2mol／LH2SO4溶液終止后檢測(cè)OD450值，確定抗體的最佳工作濃度。
1．8 單抗包被條件和多抗作用條件的確定
采用方陣滴定法，將篩選的單抗和多抗分別按最佳使用濃度稀釋，單抗采用37℃2 h、4℃12 h、4℃24h和37℃1 h后4℃ 12h4種包被條件，多抗則采用37 ℃分別作用2h、1 h和30min的工作條件，按1．7步驟進(jìn)行ELISA，分別檢測(cè)NP-40處理的陰、陽(yáng)性抗原，根據(jù)結(jié)果選擇單抗的最佳包被條件和多抗的最適作用條件。
1．9 封閉劑的應(yīng)用選擇
用單抗包被酶標(biāo)板，分別用1％BSA、1％明膠、1％BSA+1％明膠、1％BSA+1％明膠應(yīng)用2次(單抗包被后和待檢抗原作用后)4種方式封閉，然后按1．7步驟進(jìn)行ELISA，分別檢測(cè)NP-40處理的陰、陽(yáng)性抗原，根據(jù)結(jié)果選擇封閉劑的最佳應(yīng)用方法。
1．10 酶標(biāo)抗體工作條件的選擇
酶標(biāo)抗體分別按1：100、1：1 000、1：10 000、1：100 000倍稀釋，反應(yīng)條件為37℃分別作用2h、1 h和30min，按1．7步驟進(jìn)行ELISA，分別檢測(cè)NP-40處理的陰、陽(yáng)性抗原，根據(jù)結(jié)果選擇酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度和作用時(shí)間。
1．11 AC-ELISA方法陰性樣品臨界值的確定
以24份來(lái)自健康牛的脾臟組織懸液為待檢測(cè)樣品，進(jìn)行上述AC—ELISA。每份樣品重復(fù)2孔，在樣品OD450值符合正態(tài)分布的條件下計(jì)算樣品平均OD450值(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)，按文獻(xiàn)計(jì)算陰性樣品的臨界值。
1．12 AC-ELISA重復(fù)性試驗(yàn)
用單抗包被4塊酶標(biāo)板，在每一塊板內(nèi)分別檢測(cè)1份BVDV細(xì)胞培養(yǎng)抗原和4份牛病毒性腹瀉病組織病料，同時(shí)用1份正常細(xì)胞培養(yǎng)物做陰性對(duì)照，每份樣品在每塊板中重復(fù)4孔，AC-ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算樣品OD450值在不同板間和板內(nèi)不同孔間的變異系數(shù)，檢驗(yàn)板內(nèi)和板間檢測(cè)樣品的重復(fù)性。
1．13 AC-ELISA在臨床牛病毒性腹瀉病樣品檢測(cè)中的應(yīng)用
11份臨床牛病毒性腹瀉病疑似病例脾臟組織和12份健康牛脾臟組織，分別研磨勻漿后用1％NP-40處理，用AC-ELISA方法檢測(cè)BVDV抗原，同時(shí)用正常細(xì)胞培養(yǎng)物做陰性對(duì)照。上述樣品分別用病毒分離和RT-PCR方法平行檢測(cè)做對(duì)比。
2 結(jié)果
2．1 單抗純化鑒定和濃度測(cè)定
純化前后的單抗SDS-PAGE如圖1，由圖可見純化后的單抗在68 ku和25 ku附近有兩條明顯的條帶(分別是IgM的重鏈和輕鏈)，與預(yù)期的大小條帶相符。而未純化的泳道上出現(xiàn)多條雜帶。表明單抗純化結(jié)果較理想。
2．2 多抗效價(jià)測(cè)定、純化和濃度測(cè)定
采用倍比稀釋法測(cè)得純化后的多抗效價(jià)為1．2X10 4。純化前后的多抗SDS-PAGE如圖2，圖中顯示IgG在50ku和25 ku附近出現(xiàn)了明顯的條帶，代表IgG的重鏈和輕鏈，與預(yù)計(jì)大小相符，未純化多抗則有很多雜帶。表明上述純化結(jié)果很理想。經(jīng)BCA試劑盒方法測(cè)定多抗的濃度為9．08 mg／mL。
2．3 單抗和多抗最佳使用濃度的篩選
方陣滴定法篩選單抗和多抗最適工作濃度，結(jié)果見表1。單抗4G3和兔抗BVDVIgG濃度分別為5和10μg／mL時(shí)，檢測(cè)BVDV細(xì)胞培養(yǎng)抗原的OD450值為1．023，接近于1．0，且正常細(xì)胞培養(yǎng)物的OD450值為0．312，P／N值(3．278)最大，確定AC—ELISA試驗(yàn)中單抗和多抗的最適工作濃度分別為5和10μg／mL。
2．4 單抗包被條件和多抗作用條件的確定
以最適單抗?jié)舛炔捎?7 ℃ 2h、4 ℃ 12h、4 ℃24h和37℃1 h后4℃12h4種包被條件，多抗則采用37℃分別作用2h、1 h和30 min 3種不同的工作條件，組成方陣進(jìn)行AC-ELISA，分別檢測(cè)NP-40處理的陰、陽(yáng)性抗原，結(jié)果見表2。
單抗在4℃包被12 h，多抗在37 ℃作用1 h，BVDV陽(yáng)性抗原OD450值1．032，陰性O(shè)D450值0．320，P／N值為3．225；單抗在4℃包被24 h，多抗在37℃作用1 h，BVDV陽(yáng)性抗原OD450值1．066，陰性O(shè)D450值0．315，P／N值為3．384。此兩種條件下的陽(yáng)性抗原OD450值均接近1．0，P／N值均較大，單抗在4℃包被12—24h，多抗在37℃作用1 h可作為雙抗體的最佳反應(yīng)條件。
2．5 封閉劑的應(yīng)用選擇
分別用1％BSA、1％明膠、1％BSA+1％明膠、1％BSA+1％明膠應(yīng)用2次(單抗包被后和待檢抗原作用后)4種方式封閉后進(jìn)行AC-ELISA，分別檢測(cè)NP-40處理的OD450值BVDV陰、陽(yáng)性抗原，結(jié)果見圖3，用1％BSA+1％明膠封閉2次，陽(yáng)性抗原OD450值最高，陰性抗原OD450值最低，P／N值最大，為最佳封閉條件。
2．6 酶標(biāo)抗體的工作濃度和工作時(shí)間的選擇
羊抗兔IgG分別做1：100、1：1 000、1：10 000、1：100 000倍稀釋，在37℃分別作用2h、1 h和30 min，進(jìn)行AC-ELISA，檢測(cè)NP-40處理的BVDV陰、陽(yáng)性抗原，結(jié)果見表3，酶標(biāo)抗體按1：10000稀釋后37 ℃作用1 h，測(cè)得BVDV陽(yáng)性抗原OD450值最高，陰性抗原的OD450值較低，P／N值較大，為最佳反應(yīng)條件。
2．7 AC-ELISA方法陰性樣品臨界值的確定
用AC—ELISA方法檢測(cè)24份BVDV陰性的牛組織樣品，其OD450值介于0．242和0．346之間(圖4)。用SPSS 8．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，24份樣品的OD45。值符合正態(tài)分布，OD450值的平均數(shù)(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)分別為0．301和0．031，根據(jù)文獻(xiàn)計(jì)算陰性樣品的臨界值為x+3xs=0．393。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原則，OD450值>0．393時(shí)，可以在99．9％的可信度上判定為陽(yáng)性，能夠作為檢測(cè)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)。為了減少假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，將臨界值加上和減去1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的范圍作為一個(gè)可疑區(qū)間(即OD450值0．362—0．424)，介于可疑區(qū)間內(nèi)的結(jié)果需要重檢。
2．8 AC-ELISA方法的重復(fù)性試驗(yàn)
用已建立的AC—ELISA方法對(duì)1份陽(yáng)性抗原(BVDV細(xì)胞培養(yǎng)物)、1份陰性抗原(陰性細(xì)胞培養(yǎng)物)和4份疑似BVDV感染牛的脾臟組織分別在不同板間及板內(nèi)不同孔間進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果見表4。根據(jù)SSPS 8．0統(tǒng)計(jì)軟件中的隨機(jī)單位組設(shè)計(jì)資料的S-N-K方差分析方法進(jìn)行分析。不同板間比較，F(xiàn)=0．833，P=0．479>0．05；板內(nèi)不同孔間比較，F(xiàn)=0．103，P=0．958>0．05。二者差異均無(wú)顯著意義，說(shuō)明AC-ELISA方法在不同板間和板內(nèi)不同孔間檢測(cè)同一樣品差異不顯著。根據(jù)公式CV=S／Xx100％計(jì)算，6個(gè)樣品在板內(nèi)和板間的總變異系數(shù)均小于10％，可見該方法無(wú)論對(duì)陰、陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)抗原還是臨床組織樣品進(jìn)行檢測(cè)均具有較好的重復(fù)性。
2．9 AC-ELISA在臨床牛病毒性腹瀉病樣品檢測(cè)中的應(yīng)用
用AC—ELISA方法檢測(cè)臨床采集的牛病毒性腹瀉病料，同時(shí)以病毒分離和RT-PCR方法檢測(cè)做對(duì)比。用AC-ELISA、病毒分離和RT-PCR方法對(duì)11份臨床牛病毒性腹瀉病料的檢測(cè)結(jié)果分別見表5，3種方法對(duì)12份健康牛組織樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。
3 討論
牛病毒性腹瀉至今仍是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的傳染病，各國(guó)對(duì)該病都十分重視，投入很大的人力和物力進(jìn)行研究。就目前BVDV的診斷技術(shù)研究水平來(lái)看，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于BVDV其他方面的研究進(jìn)展，如何建立快速、準(zhǔn)確的BVDV檢測(cè)方法是當(dāng)前BVDV防制工作的迫切要求。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外先后建立了病毒分離、免疫熒光試驗(yàn)、單層免疫酶、酶聯(lián)免疫酶和RT-PCR檢測(cè)方法。ELISA方法以其快速、靈敏、簡(jiǎn)單并便于同時(shí)檢測(cè)大量樣品而受到人們的重視。目前國(guó)內(nèi)BVDV檢測(cè)方法還是以初步純化的BVDV細(xì)胞培養(yǎng)物作為抗原檢測(cè)BVDV抗體為主，缺乏理想的BVDV抗原檢測(cè)方法。由于國(guó)外抗原檢測(cè)試劑盒價(jià)格過(guò)于昂貴，在國(guó)內(nèi)難以推廣，建立一種敏感、快速、易操作的直接檢測(cè)牛病毒性腹瀉病抗原的試驗(yàn)方法已成為BVDV診斷工作的迫切要求。本試驗(yàn)用自行研制的BVDV單抗與兔抗BVDVIgG聯(lián)合應(yīng)用，建立了雙抗體夾心間接ELISA方法用于捕捉BVDV抗原，將單抗的高度特異性和ELISA方法的高度敏感性有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，達(dá)到了BVDV早期診斷和快速檢測(cè)的目的。AC-ELISA方法具有快速、經(jīng)濟(jì)和敏感等優(yōu)點(diǎn)，明顯優(yōu)于病毒分離、IPMA和IFA等，而且具有半自動(dòng)化的特點(diǎn)，能自動(dòng)顯示結(jié)果，因此更適宜于短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大批量樣品，適合于各級(jí)獸醫(yī)研究機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)單位應(yīng)用。
在AC-ELISA方法的建立中抗體的親合力是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵，只有制備出高效價(jià)、高親合力的特異性抗體才有可能取得成功。我們研制的單抗效價(jià)高，親合力強(qiáng)，為方法的建立打下了良好的基礎(chǔ)。同時(shí)制備了兔抗BVDV高免血清并純化了IgG，取得了較好效果。
非特異性反應(yīng)是影響ELISA結(jié)果最重要的因素，特別是在雙抗體夾心ELISA中，參與反應(yīng)的成分多，需要多重抗原抗體反應(yīng)步驟，因此降低非特異性反應(yīng)尤其重要。在消除非特異性反應(yīng)過(guò)程中，封閉劑的選擇和合理應(yīng)用非常關(guān)鍵。由于擔(dān)心動(dòng)物血清中未知雜蛋白含量過(guò)多，有可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響，本試驗(yàn)中采用BSA和明膠作為封閉劑，并進(jìn)行了封閉方式篩選試驗(yàn)，確定了將1％BSA和1％明膠分別在抗體包被后和加入待檢抗原反應(yīng)后進(jìn)行兩次封閉，取得滿意效果。
ELISA方法中結(jié)果的判定與特異性和敏感性密切相關(guān)，目前還沒(méi)有統(tǒng)一的判定標(biāo)準(zhǔn)，一般公認(rèn)的判定方法是通過(guò)檢測(cè)大量已知的陰性樣品，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算結(jié)果的平均數(shù)、平均數(shù)的99％可信區(qū)間和標(biāo)準(zhǔn)差，確定一個(gè)在99％的可信度上區(qū)分陰、陽(yáng)性結(jié)果的臨界值。張?jiān)趫?bào)道對(duì)10份以上已知陰性樣品分別檢測(cè)，取OD值平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差的和可作為臨界值，當(dāng)被檢樣品的OD值高于此值時(shí)，可判定為陽(yáng)性。本試驗(yàn)中應(yīng)用24份經(jīng)病毒分離和RT-PCR方法鑒定為BVDV陰性的牛脾臟組織分別用AC—ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，采用平均數(shù)加3倍標(biāo)準(zhǔn)差的方法確定樣品陰性臨界值為0．393，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原則，凡未知樣品的OD值高于此值時(shí)，可以在99．9％的可信度上判定為陽(yáng)性，能夠作為檢測(cè)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)。此外，本試驗(yàn)還設(shè)定了一個(gè)可疑值范圍，對(duì)介于可疑區(qū)內(nèi)的樣品進(jìn)行重檢，減少了假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果機(jī)率。
總之，本試驗(yàn)建立的BVDVAC-ELISA方法將單抗的特異性和ELISA方法的敏感性有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，能夠短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確、快速地直接檢測(cè)大批量樣品中的BVDV抗原，明顯優(yōu)于病毒分離和免疫熒光等方法，而且具有半自動(dòng)化的特點(diǎn)，能自動(dòng)顯示結(jié)果，更適合于各級(jí)獸醫(yī)研究機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)單位應(yīng)用。
lonza 無(wú)血清 培養(yǎng)基
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