【摘要】  目的：應用動態濁度法定量檢測痰熱清注射液中的細菌內毒素。方法：采用中國藥典2005年版附錄細菌內毒素定量檢測法。結果: 將痰熱清注射液進行1∶80稀釋，可排除干擾，回收率在50％～200％，無干擾作用。結論：應用動態濁度法測定痰熱清注射液中的細菌內毒素是可行的。

【關鍵詞】  動態濁度法；痰熱清注射液；細菌內毒素；干擾實驗

痰熱清注射液是由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翹制成的中藥復方注射劑,臨床上用于風溫肺熱病屬痰熱阻肺證。本品的質量標準［1］中規定其致熱物質檢查為熱原檢查法，該法操作復雜、時間長、費用高。本文通過動態濁度法定量檢測痰熱清注射液中的細菌內毒素含量，建立痰熱清注射液中細菌內毒素定量分析的方法。

　　1  材料與儀器

    動態濁度鱟試劑（批號：0411260，0409228，1.25 mL/支，湛江安度斯生物有限公司）；細菌內毒素工作標準品（批號：200610，160 Eu/支，中國藥品生物制品檢定所）；痰熱清注射液（批號：050915、050926、051026、051125，10 mL/支，新誼醫藥集團·上海凱寶藥業有限公司）；BET32B型細菌內毒素測定儀（天津大學無線電廠）；ZH2型漩渦混合器（天津藥典儀器廠）。

　　2  方法與結果

　　2.1  細菌內毒素限值的確定［2］

    人體每小時可以接受的最大內毒素劑量為［5.0 EU/(kg·h) × 60 kg］=300 EU/h（人均體重按60 kg計算）；按痰熱清注射液使用說明書，20 mL/次，加入5%葡萄糖注射液500 mL，控制滴數在60滴/min內（按每1 mL為20滴計算），另葡萄糖注射液的內毒素限量為0.5 EU/mL；故痰熱清注射液允許帶入的內毒素最大限量為［300×(500+20)×20/(60×60)-500×0.5］÷20＝30.8 EU/mL。本試驗采用30.8 EU/mL作為細菌內毒素限值。

　　2.2  標準曲線的制作及可靠性［3］

    用細菌內毒素檢查用水將細菌內毒素工作標準品進行溶解稀釋，使其最終內毒素濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312 Eu/mL稀釋系列。各取0.2 mL分別加到預先加有0.1 mL動態濁度鱟試劑反應管內，混合均勻。立即插入BET32B型細菌內毒素測定儀進行自動檢測，其中每一濃度做3支平行管，并同時做2支陰性對照管（NC）。結果見表1。表1  標準曲線的可靠性試驗（略）

    結果標準曲線為lgT=2.81660.3533lgC，r=0.9928，｜r｜>0.980,標準曲線最低內毒素濃度點λ1＝0.0312 Eu/mL，陰性對照的反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間，標準曲線成立。

　　2.3  干擾實驗

　　2.3.1  供試品最大稀釋倍數計算［3］ 

　　按公式MVD=L·C/λ，L為痰熱清注射液細菌內毒素限值，C為100%，λ為標準曲線的最低內毒素濃度0.0312 Eu/mL，得最大稀釋倍數（MVD）為987倍。

　　2.3.2  供試品溶液配制及預干擾實驗［4］ 

　　將痰熱清注射液（批號：050915）用細菌內毒素檢查用水依次稀釋為1∶20、1∶40、1∶80、1∶160等比系列稀釋液，作為供試品空白管（Ct），記為A液。同時另分別取內毒素標準溶液濃度為2 λm （λm為中點濃度0.125 Eu/mL）和供試品各等比系列的2倍濃度稀釋液，在稀釋用試管中等量混合，得到在此稀釋倍數下含λm內毒素的供試品溶液，作為供試品陽性管（Cs），記為B液。分別取上述溶液各0.2 mL加入預先加有0.1 mL動態濁度法鱟試劑反應管內，混合均勻。立即插入BET32B型細菌內毒素測定儀進行自動檢測，其中每一濃度做2支平行管，并同時做2支陰性對照管（NC）。計算回收率，回收率（％）=(Cs-Ct)/λm×100％，結果見表2。表2  預干擾實驗結果（略）

    結果可見，陰性對照內毒素小于標準曲線最低內毒素濃度點λ1＝0.0312 Eu/mL，陰性合格。供試品等比稀釋液中，1∶20稀釋液的回收率為216.7%，說明該稀釋液對鱟試劑有增強作用。1∶40、1∶80、1∶160稀釋液的回收率均在50％～200%之間，符合中國藥典規定。1∶80稀釋液的回收率接近100％，最接近真實值，在日常檢查中，選1∶80稀釋液為宜。

　　2.3.3  干擾實驗 

　　另取3批痰熱清注射液，用細菌內毒素檢查用水稀釋為1∶80稀釋液，作為供試品空白管，記為A液。同時分別取內毒素標準溶液濃度為2 λm和供試品1∶40稀釋液，在稀釋用試管中等量混合，得作為供試品陽性管，記為B液。分別取兩批鱟試劑進行試驗。分別取上述溶液各0.2mL加入預先加有0.1 mL動態濁度法鱟試劑反應管內，混合均勻。立即插入BET32B型細菌內毒素測定儀進行自動檢測，其中每一濃度做2支平行管，并同時做2支陰性對照管（NC）。結果見表3。表3  干擾實驗結果（略）

    結果可見，陰性對照內毒素小于標準曲線最低內毒素濃度點λ1＝0.0312 Eu/mL，陰性合格。供試品1∶80稀釋液的回收率均在50％～200%之間，則該稀釋液對鱟試劑反應無干擾作用。

　　2.4  定量檢查

    根據以上干擾實驗結果，對4批痰熱清注射液以1∶80稀釋液進行定量檢查。結果見表4。表4  定量檢查結果（略）

　　3  討論

    痰熱清注射液為中藥制劑，其成分較復雜，故細菌內毒素限值應從嚴考慮。本法結合臨床實際用藥及考慮葡萄糖注射液的加和性，確保細菌內毒素限值安全、可靠。

    在實驗中采取熱原法和動態濁度法在相同實驗條件下同時測定，兩種實驗方法得到一致的結果，符合中國藥典對細菌內毒素實驗成立的規定。動態濁度法定量進行細菌內毒素檢測具有操作簡便，結果準確，檢測靈敏度高，減少人為誤差，幫助分析干擾情況和可以觀察反應過程等優點。

【參考文獻】
  　　［1］國家食品藥品監督管理局. 國家藥品標準(試行)［S］.（YDZ00912003）.

　　［2］苑慶華, 芮 菁, 華曉東, 等. 動態濁度法定量檢測替硝唑注射液中內毒素研究［J］. 中國藥學雜志, 2003, 38(12): 952953.

　　［3］中華人民共和國藥典委員會. 中華人民共和國藥典(二部)［S］. 2005年版. 北京: 化學工業出版社, 2005: 附錄85.

　　［4］邱文煒, 詹云麗, 劉一波, 等. 動態濁度法定量測定魚腥草注射液中內毒素含量［J］. 廣東藥學院學報, 2004, 20(6): 621622.

作者：林穎，陳華龍    作者單位：韶關學院醫學院，廣東韶關 512026
 

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