1 問：請問對同樣培養的相同濃度的細胞，用ELISA檢測其上清液相同細胞因子的濃度，不同的報道差別為什么很大？

參考解析：不同廠家的試劑盒當然有很大影響。ELISA非常敏感，即使是同一個試劑盒，用同一個廠家同一濃度的刺激因子，incubate 時間不同也會影響結果，這就是為什么每次都要設內部和外部對照的原因。這主要和其抗體標準品原料來源有關，建議購買ELISA試劑盒時選擇大公司提供的產品，這樣結果比較可靠一點。

2 問：ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育？

參考解析：溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度

3 問：檢測疫苗免疫小鼠后的抗體情況。用了商品化的試劑盒。
       1 商品化的板子已經用病毒裂解液包被了。
       2 洗3次后，將陽性和陰性血清（豬），樣品血清（小鼠）1：40稀釋加入，留2個空做空白對照，30分鐘37度
       3 洗3次，在一個空白空中加入山羊抗小鼠二抗（1:1000），一個加入商品化已稀釋抗豬二抗（不知稀釋倍數）。在陽和陰中加入抗豬二抗，樣品中加入抗鼠二抗。
       4 洗4次。經加入底物AB侯顯色15分鐘。終止。測630nm
 結果加入豬二抗的空白空為0.277；陽性為0.964，陰性為0.503% 
       假如鼠二抗的空白空為0.951：個樣品都在1.000作用
       請問為什么兩個空白空的值差那么多？是不是鼠二抗與包被的病毒抗原結合，還是二抗的稀釋倍數不夠？或者其他原因？

參考解析：

       1首先抗豬二抗和抗鼠二抗本來就是不同的東西（且稀釋度不同），在沒有非特異性結合出現的情況下，應該是OD值相差無幾，但是從現在的結果看，肯定是二抗有非特異性的結合（這一點從加入的樣品鼠血清孔 與 鼠二抗空白孔差別不大也可以看出來），故造成兩孔OD值差異。
       2 當然這么高的本底也有可能是你的抗體濃度使用稀釋度不當或者洗板不徹底（殘余大量未結合的酶標抗體）造成的，請首先查明。
       3 不知道你使用的是什么底物進行顯色，好像常規ELISA實驗的底物是沒有檢測波長在630nm的。
       4 排除了2.3兩點的問題再考慮是否是二抗不純并與包被的病毒裂解物結合的問題。
    你加入的商品化稀釋的抗豬二抗，卻不知道稀釋度，這在ELISA實驗中是不可取的，酶標抗體的濃度過高必然引起顯色本底很高。 你可以取包被的板條不加樣品直接加入梯度稀釋的酶標記二抗，取OD值在0.1以下時的稀釋度再進行檢測。若檢測值很低則是抗體的敏感性問題，應當更換其它抗體。

4問：請教一下，用雙夾心ELISA法檢測，用菌體免疫的小鼠和家兔，免疫后采集血清，可以直接包被血清嗎，還是需要純化后在包被？ 菌體與佐劑乳化時需要無菌操作嗎？裝血清用無菌操作嗎？

參考解析：血清不可以直接包被，主要是因為血清的pH和離子強度與通用的包被液不同，而且會造成一些非特異蛋白質的吸附，不利于特異性抗原或抗體的檢測。
純化血清的方法很多，一般有鹽析法和柱層析法，也可二者聯合使用，視對純度要求不同而異。一般鹽析法（比如硫酸銨沉淀）純化后就可獲得主要的免疫球蛋白，而去除其他雜蛋白（如白蛋白等），如果需要進一步純化的話，還可用凝膠層析法或離子交換層析法來進一步純化獲得IgG，如果抗原足夠純的話，也可以用親和層析法來做，但這些實驗會導致抗體效價的下降和免疫球蛋白的損失，所以要充分衡量利弊再做決定

5問：要在balb/c小鼠上，免疫蛋白，做個預實驗，elispot檢測CTL，elisa檢測抗體，我想不加強免疫，在第一次免疫一周后，就做能出結果嗎？

參考解析：加強免疫只是增加血液中抗體滴度，只是量的增加，理論上不影響定性檢測。elisa的敏感性很高，第一次免疫后，CTL和抗體都應該能夠檢測到，但實際操作對實驗結果影響很大，具體檢測效果如何，你應該試著做做。

本底及假陽性產生的原因分析

1. 基因工程抗原與合成肽抗原的區別
      基因工程抗原是抗原基因在質粒載體中原核或真核表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達系統。該類抗原與合成肽相比具有以下特點：
a.分子量大。合成肽采用化學方法制備，由于工藝的局限，合成數量有限，只能達到數百個氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。

引起ELISA測定錯誤結果的原因主要有：
 1．標本因素；
 2．試劑因素；
 3．操作因素。

本文就標本因素對ELISA測定的影響做如下討論。 

     血清是最常用的ELISA標本，血漿一般可視為與血清同等的標本，標本引起的假陽性和假陰性結果主要是干擾性物質所致，分為內源 性物質和外源性物質兩種：
1．內源性物質
    有人認為大約40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質，可以不同程度影響檢測結果。
    常見的干擾物質有：類風濕因子、補體、嗜異 性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫源性誘導的抗鼠Ig (s)抗體、交叉反應物質和其它物質等。
（1）類風濕因子 
    人血清中IgM、IgG型類風濕因子（RF）可以與ELISA系統中的捕獲抗體及酶標記二抗的FC段直接結合，從而導致假陽性。 解決該情況的辦法是：①用F(ab)2替代完整的IgG；②標本用聯有熱變性（63℃，10 min）IgG的固相吸附劑處理（將熱變性IgG加入到標本稀釋液中同樣有效）；③檢測抗原時，可以用2-巰基乙醇等加入到標本 稀釋液中，使RF降解。
（2）補體 
     ELISA系統中固相一抗和標記二抗過程中，抗體分子發生變構，其FC段的補體C1q分子結合位點被暴露出來，使C1q 可以將二者連接起來，從而造成假陽性。解決的辦法是：①用EDTA稀釋標本；②用53℃，10 min或56℃，30 min加熱血清使C1q滅活。
（3）嗜異性抗體 
     人類血清中含有能與嚙齒類動物（如鼠等）Ig (s) 結合的天然嗜異性抗體，可將ELISA系統中一抗和二抗連接起來，也能造成假陽性。解決的辦法是：可在標本稀釋液中加入過量的動 物Ig (s) ，但加入量不足或亞類不同時無效。
（4）嗜靶抗原的自身抗體 
     抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時能與靶抗原結合形成復合物，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測定結果。 為避免以上情況出現，解決的辦法是：測定前需用理化方法將其解離后再測定。
（5）醫源性誘導的抗鼠Ig (s) 抗體
      臨床開展的用鼠源性CD3等單克隆抗體治療，用放射性同位素標記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術，均有可能使這些病人體 內產生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類動物咬傷的病人體內也可以產生抗鼠Ig (s) 抗體。這些病人ELISA測定時均可產生假陽性。解決的辦法是：測定抗原時，在標本中加入足量的正常鼠Ig (s) ，從而克服由于上述原因造成的假陽性。
（6）交叉反應物質 
      類地高辛、類AFP樣物質等，是與靶抗原有交叉反應的物質。在用多抗測定抗原時對測定結果影響不大，但在用單克隆抗體測定抗原時 ，如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對應的靶決定簇時，也會出現假陽性結果。
（7）標本中其它成分的影響 
       血清脂質過高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過大等，均對ELISA測定結果有干擾作用。

2．外源性物質 
       外源性物質常常是由于用于ELISA測定的血標本的采集、貯存等不當所致。如標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存過久、標本凝集 不全和采血管中添加物等影響。
（1）標本溶血 
    由于各種人為原因引起的標本溶血，均可因紅細胞破壞溶解時釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶為標記的 ELISA測定中，會導致非特異性顯色，干擾測定結果。為克服上述干擾作用，標本采集時必須注意避免溶血。
（2）標本受細菌污染 
     因菌體中可能含有內源性辣根過氧化物酶，因此，被細菌污染的標本同溶血標本一樣，亦可產生非特異性顯色而干擾測定結果。 
（3）標本保存不當 
     在冰箱中保存過久的標本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測定中會導致本底過深、甚至造成 假陽性；標本放置時間過長（如一天以上），有時抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現假陰性。為克服上述干擾，ELISA測定的血清 標本宜為新鮮采集；如不能立即測定，5天內測定的血清標本可存放于4℃，1周后測定的血清標本應低溫凍存；凍存后融解的標本，蛋 白質局部濃縮，分布不均，應充分混合后再測定，但混勻時應輕柔，不可強烈振蕩。 
（4）標本凝集不全
     在沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下，正常血液采集后1/2~2h開始凝固，18~24h完全凝固。臨床檢驗工作中，有時為了爭取 時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成 肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果；這類情況于次日復查時因血凝已完全，血清中不再有纖維蛋白原存在，故復查結果變為陰性 。為避免上述干擾作用，解決的辦法最好是血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血 管中加入適當的促凝劑。 
（5）標本管中添加物質的影響 
    抗凝劑（如肝素，EDTA）、酶抑制劑（如NaN3可抑制ELISA系統中辣根過氧化物酶活性）及快速分離血清的分離膠等均對E LISA測定有一定干擾作用。 綜上所述，對臨床檢驗ELISA測定中出現的假陽性或假陰性結果，在考慮試劑因素和操作因素之外，更多的應從標本因素方面進行分析，并應采取相應措施排除干擾作用，從而為臨床提供正確可靠的檢測結果。