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循環(huán)microRNA與腫瘤診斷
鐵軼, 付漢江, 鄭曉飛*
軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所, 北京 100850
* 聯(lián)系人, E-mail: xfzheng100@126.com
收稿日期: 2008-09-22; 接受日期: 2008-11-28
國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 30870529和30873008)和“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”重大科技專項(批準(zhǔn)號: 2008ZX10002-016)資助項目
摘要 miRNA是一類小分子調(diào)控RNA, 在腫瘤的發(fā)生與控制方面發(fā)揮著重要的作用. 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者的循環(huán)核酸中存在源自腫瘤的miRNA分子, 這一現(xiàn)象提示循環(huán)miRNA分子可能成為無創(chuàng)診斷癌癥的一個有效的方法. 本文綜述了循環(huán)miRNA作為循環(huán)生物標(biāo)志物在腫瘤診斷中的應(yīng)用, 以及該領(lǐng)域的最新研究進展.
關(guān)鍵詞
循環(huán)miRNA 腫瘤 診斷
半個多世紀(jì)前, Mandel和Metais[1]發(fā)現(xiàn)血漿和血清中存在循環(huán)核酸(circulating nucleic acids, CNAs). 循環(huán)核酸屬于細胞外核酸(extracellular nucleic acids, ENAs), 細胞外核酸按照種類可以分為DNA和RNA. 其中細胞外RNA按照其所處位置可以分為細胞膜結(jié)合RNA(cell bound RNA)、循環(huán)RNA (circulating RNA)和細胞外基質(zhì)RNA(RNA in the extracellularmatrix). 研究揭示, 正常人血漿內(nèi)存在RNA, 細胞外普遍存在RNA[2]. 從發(fā)現(xiàn)循環(huán)核酸開始, 人們就一直致力于循環(huán)核酸用于臨床疾病的無創(chuàng)診斷預(yù)警方面的應(yīng)用研究中. 隨著檢測技術(shù)方法的不斷進步, 對于循環(huán)核酸在疾病診斷中的應(yīng)用研究有了實質(zhì)性的進展, 在循環(huán)RNA作為腫瘤診斷和預(yù)后、器官移植監(jiān)測、急性疾病診斷、產(chǎn)前遺傳疾病的診斷等領(lǐng)域都取得了一些重要成果[3,4]. 對腫瘤的研究發(fā)現(xiàn), 患者血漿中RNA的含量明顯增加. 瘤細胞基因表達模式與正常組織有明顯的不同, 可以通過檢測腫瘤病人循環(huán)RNA中的腫瘤特異的mRNA來進行腫瘤的診斷, 因此血漿RNA分子用作癌癥的診斷標(biāo)志分子顯示了良好的應(yīng)用前景[5,6]. 近年來新發(fā)現(xiàn)的microRNA (miRNA)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著極為密切的關(guān)系. 基于miRNA在腫瘤中的表達往往是失調(diào)的, 且具有組織特異性, miRNA在血液中有異常高的穩(wěn)定性這些事實, 研究者推測miRNA可能是一個理想的基于血液的腫瘤檢測生物標(biāo)志物. 最近在這一應(yīng)用研究領(lǐng)域取得了重要進展, 本文將對此給予介紹.
1 miRNA與腫瘤
miRNA是一類長約19~24 nt的非編碼單鏈小RNA分子, 在動物中, 絕大多數(shù)miRNA可以通過與靶基因3′UTR區(qū)互補結(jié)合, 抑制靶基因翻譯成蛋白質(zhì), 進而在細胞、組織或個體水平上影響生物體的生長發(fā)育, 并參與多種疾病過程[7,8]. 一系列的研究表明miRNA在細胞生長和凋亡、血細胞分化、同源異形盒基因調(diào)節(jié)、神經(jīng)元的極性、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成、心臟發(fā)生、胚胎發(fā)育和脂肪代謝等過程中發(fā)揮重要作用. 雖然對已發(fā)現(xiàn)的miRNA分子的功能和作用靶基因了解的還很少, 但是對miRNA在不同組織和疾病中的表達譜分析發(fā)現(xiàn), miRNA的表達譜具有明顯的組織特異性, 在一些疾病中miRNA的表達譜改變具有明顯的特征, 尤其是在腫瘤疾病中. 正
常組織和腫瘤組織中miRNA表達明顯改變. miRNA
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在不同腫瘤中具有特定的表達模式. miRNA在腫瘤中表達的這些特點在肝癌、肺癌、腸癌、卵巢癌和白血病等多種惡性腫瘤中得到了證實[9]. 這些特點也使miRNA有可能成為腫瘤診斷的新的生物學(xué)標(biāo)記和治療藥物作用的靶標(biāo). 鑒于血清中循環(huán)RNA在腫瘤診斷和預(yù)后應(yīng)用研究中取得了重要進展, 國內(nèi)外的多家實驗室開展了循環(huán)miRNA作為腫瘤無創(chuàng)診斷生物學(xué)標(biāo)志物的研究, 并取得了重要成果.
2 循環(huán)miRNA的存在
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并被miRBase數(shù)據(jù)庫[10]收錄的人類miRNA分子有695種. 其中絕大部分的miRNA分子在不同病理和生理狀況下進行表達, 并且多數(shù)miRNA能夠在人體液中檢出. Chen等人[11]應(yīng)用Solexa測序技術(shù)對正常的中國人血清miRNA進行測序分析, 在男性和女性血清中分別發(fā)現(xiàn)了100種和91種miRNA分子. Taylor和Gercel-Taylor[12]分析了來自同一卵巢癌患者的癌細胞和分離自血清的外來體(exosome)中的miRNA, 在被分析的467種miRNA中有218種呈陽性. Mitchell等人[13]為了證實人體血漿中是否存在miRNA分子, 分離了健康人血漿中的18~24 nt的RNA, 構(gòu)建了小RNA文庫, 對得到的125個DNA克隆進行測序分析, 在所采用的血漿樣本中克隆到了37種miRNA分子, 其中包括let-7a, miR-16和miR-15b等. 對其中克隆到的中等豐度的miR-16和miR-24, 低豐度的miR-15b采用qRT-PCR方法進行檢測, 在3位正常人血漿中3種miRNA分子表達量在每微升血漿8,910~133,970拷貝之間. 已有的對正常人和不同疾病人血清和血漿中miRNA檢測結(jié)果表明, miRNA分子同已知的循環(huán)核酸(DNA和RNA)一樣, 廣泛存在于正常人和不同種病人的血清和血漿中, 并且隨著生理狀況、疾病的種類和病程的不同, miRNA分子在血清和血漿中存在的種類和數(shù)量將發(fā)生變化. 循環(huán)miRNA在體液中的存在量雖然高低不同, 但是完全可以采用基因擴增技術(shù)進行檢測. 這一事實為循環(huán)miRNA作為疾病無創(chuàng)診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物提供了潛在的可能.
循環(huán)miRNA是如何產(chǎn)生的？其生物學(xué)功能又是什么？一系列的問題還有待闡明. 對于循環(huán)miRNA的來源目前主要觀點有: 循環(huán)RNA來自于凋亡或壞死的細胞, 細胞的主動釋放, 以及循環(huán)細胞的裂解. 但對于特定循環(huán)miRNA的真實來源還存在許多未知的因素. 研究表明, 內(nèi)源循環(huán)miRNA分子多數(shù)不是以游離形式存在的, 常與蛋白等構(gòu)成顆粒存在, 因而內(nèi)源性的循環(huán)RNA分子具有良好的抗RNase降解能力, 有較高的穩(wěn)定性. 這一特點也為循環(huán)RNA發(fā)揮生物學(xué)功能提供了前提保證. Benner[14,15]早在1988年就曾提出“細胞外通訊RNA(extracellular communication RNA)”假說, 并認為細胞外RNA在細胞增殖和分化中起重要作用. Valadi等人[16]最近在研究人和小鼠的肥大細胞系(HMC-1和MC/9)外來體時發(fā)現(xiàn)其中存在mRNA和miRNA分子, 體外翻譯證明外來體mRNA是有功能的. 實驗還發(fā)現(xiàn)外來體RNA可以實現(xiàn)在細胞間的轉(zhuǎn)移, 小鼠外來體mRNA轉(zhuǎn)移到人肥大細胞中后, 在受體人細胞中可已檢測到鼠蛋白的表達, 這表明外來體mRNA和miRNA可以從一個細胞轉(zhuǎn)移到另外的細胞中, 并且在新的細胞中發(fā)揮功能. Valadi等人將這種RNA命名為外來體穿梭RNA(exosomal shuttle RNA, esRNA). 已有的部分研究結(jié)果已經(jīng)充分說明細胞外的循環(huán)RNA分子并不是“垃圾RNA”(junk RNA), 循環(huán)RNA可能在生物體中具有重要的生物學(xué)功能. 對細胞外RNA的了解, 將豐富對RNA生物學(xué)功能的認識, 這對全面闡釋生命的本質(zhì), 提高人類的健康水平具有重要意義.
3 循環(huán)miRNA檢測方法
RNA分子易于降解, 循環(huán)RNA的含量一般較低, 在一定程度上限制了體液中RNA分子作為生物標(biāo)志物的應(yīng)用. 但是, 最近研究結(jié)果表明循環(huán)miRNA在血清和血漿中通常是與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起, 具有良好的穩(wěn)定性. 這就為循環(huán)miRNA作為生物標(biāo)記物進行檢測提供了可能. 目前已經(jīng)發(fā)展了多種有效的miRNA檢測方法, 根據(jù)研究目的和樣品來源的不同可以選擇最適合的檢測方法. 對于發(fā)現(xiàn)新的miRNA分子, 克隆測序仍是首選方法[17,18]. Northern blot是驗證和確認miRNA的重要方法, 但該方法繁瑣并且靈敏度較低, 不適用于臨床樣本的高通量檢測[19]. RT-PCR方法是檢測miRNA表達的一種常用方法, 實時定量PCR(quantitative real-time PCR)可以很精確地定量分析miRNA的表達. 基于PCR原理的miRNA檢
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鐵軼等: 循環(huán) microRNA 與腫瘤診斷
測方法有多種, 常用的有基于莖-環(huán)的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)[20], 基于polyA加尾的RT-PCR方法[21], 以及其他類似的方法. 實時定量PCR是循環(huán)miRNA定量檢測最常用的有效方法. 另外芯片技術(shù)(microarray)檢測方法可以實現(xiàn)快速、高通量的檢 測[22]. 目前已有多種類型的miRNA檢測芯片可以選用. 但是基因芯片檢測方法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性比較差, 一般多用于初篩, 對獲得的結(jié)果通常需要采用Northern blot和實時定量PCR進行驗證. 最近, Driskell等人[23]建立了表面增強拉曼光譜法(surface- enhanced Raman spectroscopy, SERS)用于miRNA檢測和分類. Kato[24]建立了一種新的采用熒光DNA探針檢測成熟miRNA的技術(shù). 目前miRNA檢測限已經(jīng)可以達到fM水平. 隨著研究的深入, miRNA檢測方法將會不斷完善和規(guī)范化, 最終將建立一套高靈敏度、高精確度的循環(huán)miRNA檢測方法.
循環(huán)miRNA檢測過程中, 樣品的處理和RNA制備十分重要. Mitchell等人[13]采用EDTA作為血液抗凝劑, 血清和血漿miRNA提取采用mirVana PARIS試劑盒, 與常規(guī)提取RNA所不同的是, 用等體積酸性酚-氯仿抽提樣品兩次以更好地去除蛋白成分. Chen等人[11]采用Trizol方法提取血清中的miRNA分子, 為了去除血清中的蛋白, 也增加了酚-氯仿抽提步驟. Gilad等人[25]采用了不同方法制備血清miRNA, 首先用蛋白酶K消化血清, 然后用酸性酚-氯仿抽提, 乙醇沉淀, 水溶解, DNase消化, 再次用酸性酚-氯仿抽提.
Mitchell等人[13]的檢測結(jié)果表明血漿室溫放置24 h, 或經(jīng)過8次凍融, 采用基于莖-環(huán)的RT-PCR方法檢測, 內(nèi)源miRNA的量沒有明顯變化, 證明血漿中的內(nèi)源miRNA分子是穩(wěn)定的. 采用基于莖-環(huán)的RT-PCR方法, 即使不提取血清中的miRNA, 直接以血清為模板也能夠檢測到miRNA分子. 對不同極端條件下血清miRNA穩(wěn)定性研究表明, 經(jīng)過多次凍融, 極端pH(pH 1和pH 13)處理3 h, 血清miRNA仍有極好的穩(wěn)定性. Gilad等人[25]對miRNA檢測采用的方法是首先進行polyA加尾, 然后用帶有錨定引物的oligodT進行反轉(zhuǎn)錄, 之后進行PCR反應(yīng), 用探針進行檢測, 同樣獲得了良好的結(jié)果. 檢測結(jié)果表明解凍的血清室溫放置4 h對不同miRNA的量沒有明顯的改變, 但血清經(jīng)過兩次凍融會稍有影響, 但是不影響血清miRNA作為生物標(biāo)志物的檢測. 在血漿和血清中, 同一種miRNA的檢測結(jié)果具有極好的相關(guān)性, 說明血清和血漿miRNA都適合用于生物標(biāo)記檢測.
上述研究結(jié)果表明, 血清中的miRNA分子有良好的穩(wěn)定性, 采用常規(guī)RNA提取方法就可以獲得滿足實驗要求的miRNA. 對于血清中miRNA分子的檢測, 實時定量PCR是最適用和有效的方法. 這些便利條件為臨床大規(guī)模檢測奠定了基礎(chǔ). 今后需要建立和形成一套標(biāo)準(zhǔn)化的血液樣本采集、運輸保存、RNA提取制備和實時定量PCR檢測技術(shù)體系, 以及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng), 確保miRNA檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化.
4 循環(huán)miRNA在腫瘤檢測中的應(yīng)用
理想的循環(huán)miRNA標(biāo)志物是在腫瘤細胞中等或高水平表達, 在健康人血漿中檢測不到或低水平存在. Mitchell等人[13]為了驗證血清中是否存在來自腫瘤的循環(huán)miRNA分子, 設(shè)計了一個精巧的實驗, 將人前列腺癌細胞22Rv1接種到NOD/SCID免疫缺陷小鼠體內(nèi), 在接種癌細胞的小鼠血漿中檢測到了源自人腫瘤細胞, 而在小鼠中沒有同源基因的miR- 629*和miR-660, 并且miR-629*和miR-660豐度與移植瘤小鼠腫瘤的大小有一定的相關(guān)性. 這一實驗結(jié)果表明源自腫瘤的miRNA能夠進入血液循環(huán), 循環(huán)miRNA的量一定程度可以反映腫瘤的大小. 隨后, 選擇了miR-100, miR-125b, miR-141, miR-143, miR- 205和miR-296作為人前列腺癌候選標(biāo)志物, 并進行了深入研究. 對25個轉(zhuǎn)移性前列腺癌和25個健康人血清進行分組檢測, 結(jié)果miR-141在前列腺癌患者血漿中含量明顯高于對照組, 并且與前列腺特異抗原(prostate-specific antigen, PSA)水平有一定的相關(guān)性. 上述結(jié)果表明, miR-141可以成為檢測前列腺癌的循環(huán)miRNA標(biāo)志物.
Chen等人[11]采用Solexa測序方法對健康人血清、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和腸癌(colorectal cancer, CCS)患者血清中的小RNA分子進行測序分析. 與對照血清相比, 肺癌血清miRNA譜明顯不同, 28種正常血清中存在的miRNA沒有檢出, 但是新檢測出了63種在正常血清中沒有的miRNA分子. 而且肺癌血清miRNA譜與肺癌血細胞(lung cancer blood cell, LCC)miRNA譜也存在明顯的
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Gilad等人[25]采用實時定量PCR方法檢測了10名非孕婦、10名妊娠早期和10名妊娠晚期孕婦血清miRNA譜, 共檢測了28種miRNA分子, 其中包括在胎盤中表達的miRNA. 結(jié)果所有胎盤表達miRNA在孕婦血清中高表達. 其中血清中miR-526a和miR- 527水平在妊娠晚期顯著上升. 研究發(fā)現(xiàn), 胎盤miR- 526a, miR-527和miR-520d-5p可以用來準(zhǔn)確地辨別是否妊娠. 可見, 循環(huán)miRNA還可以反映特定的生理變化.
差別, 有57種miRNA在肺癌血清和肺癌血細胞中共有, 但有76種miRNA僅在肺癌血清中檢出. 這一點與健康人也不同, 健康人血清和血細胞的miRNA譜基本相同. 隨后對差別最大的miR-25和miR-223進行了驗證, 檢測了152例肺癌血清和75例健康人血清, miR-25和miR-223在肺癌患者血清中高表達得到了驗證. Chen等人[11]采用同樣的方法分析了腸癌血清miRNA, 結(jié)果在腸癌血清中檢測出了69個正常血清中沒有的miRNA. 但是卻發(fā)現(xiàn)腸癌血清與肺癌血清中的miRNA有相當(dāng)數(shù)量的重疊, 這提示癌癥患者血清中可能存在共同的miRNA分子.
對于循環(huán)miRNA與腫瘤及其他疾病的關(guān)系研究尚處于起步階段, 但現(xiàn)有研究結(jié)果已為疾病的無創(chuàng)診斷研究開辟了一條新的道路.
卵巢癌的早期診斷對于提高生存率十分重要, 但是大多數(shù)患者被確診時已進入晚期. Taylor和Gercel-Taylor[12]對卵巢癌腫瘤釋放到血液中的外來體中的miRNA進行了檢測, miR-21, miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-200b, miR-203, miR-205和miR-214等8種miRNA在卵巢癌細胞和外來體中水平相當(dāng), 而來自良性卵巢疾病和卵巢癌患者的EpCAM陽性的外來體中miRNA譜明顯不同. 這一結(jié)果表明, 循環(huán)腫瘤外來體中miRNA譜可能用于卵巢癌的篩查.
6 展望
miRNA分子廣泛參與基因表達調(diào)控、生物應(yīng)激和非生物應(yīng)激反應(yīng). miRNA分子不僅自身作為功能分子發(fā)揮作用, 還廣泛參與和決定基因表達調(diào)控和蛋白質(zhì)翻譯, 進而影響細胞的新陳代謝等所有生命過程. miRNA標(biāo)志物將成為疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因標(biāo)志物、蛋白質(zhì)標(biāo)志物和代謝物標(biāo)志物整體“網(wǎng)絡(luò)”中的“結(jié)點”, 可以實現(xiàn)從蛋白質(zhì)、DNA和RNA三大生物分子方面對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進行預(yù)警和預(yù)后. 因此, 循環(huán)miRNA分子標(biāo)志物, 將改變和補充對腫瘤發(fā)生發(fā)展的傳統(tǒng)認識, 整合血清基因組、蛋白質(zhì)組、多肽組和代謝組等研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)的腫瘤生物標(biāo)志物, 將全方位認識腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機制, 有可能提供腫瘤診斷和治療的組合生物標(biāo)志物. 隨著循環(huán)miRNA檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化, 以及對循環(huán)miRNA的生成機制、生物學(xué)功能和與相關(guān)腫瘤的關(guān)系的逐步闡明, 可以相信循環(huán)miRNA在未來的臨床無創(chuàng)疾病診斷和預(yù)后中將展示出廣闊的臨床應(yīng)用前景.
5 循環(huán)miRNA與其他臨床診斷
Chen等人[11]還采用Solexa測序方法對糖尿病(diabetes)患者血清中的小分子RNA進行測序分析. 糖尿病患者血清miRNA譜與正常血清相比也有明顯的不同, 雖然沒有腫瘤血清與正常血清的差別大. 有意思的是, 糖尿病血清與肺癌血清共有大量正常血清中沒有的miRNA. 糖尿病血清與糖尿病血細胞共有84種相同的miRNA, 它們分別獨有17和27種miRNA. 泊松相關(guān)散點圖顯示, 血清miRNA改變比血細胞miRNA改變能更敏感地反映糖尿病患者的病情.
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