問題

可能原因

解決方法

無顏色

試劑孵育的時間沒有按說明書操作。

確定生物素化抗體，連接的HRP試劑或鏈霉親和素-HRP使用的時間是否適當(dāng)。

不同試劑盒或不同批號的試劑混用。

重新檢查試劑的標(biāo)簽，確準(zhǔn)所有組分都屬于正使用的試劑盒中的。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。

漏加酶

檢查操作流程，注意不要漏加

HRP酶污染了疊氮鈉

使用新配制的試劑，禁含疊氮鈉

標(biāo)準(zhǔn)品有問題（若在標(biāo)本孔中有信號）

按說明書檢查標(biāo)準(zhǔn)品的制備使用1瓶新標(biāo)準(zhǔn)品

某一容器未洗凈,殘留滅活酶物質(zhì)

盡可能用試劑盒內(nèi)容器,另覓一定要潔凈、可靠

使用含血清的緩沖液配制/復(fù)溶抗體

重新確認(rèn)所選用的試劑

.漏加顯色劑A或B

加顯色劑后觀察一下液面高度

試劑配制/使用有誤

將實驗重做；嚴(yán)格按說明書操作，每次配制和使用前看清標(biāo)簽。

緩沖液污染

配制新新鮮的緩沖液

顯色弱

超過有效期的產(chǎn)品可能會產(chǎn)生很弱的信號。

檢查產(chǎn)品的有效期

加入試劑的體積和時間有誤

確定所使用的每一個試劑的體積正確的和加入的時間是適當(dāng)?shù)摹?/p>

試劑、樣品用前未能平衡

用前試劑、樣品置室溫平衡10分鐘左右

縮短孵育時間能使實驗的信號變?nèi)酢?/p>

檢查孵育的時間。

在溫度變化的環(huán)境內(nèi)孵育酶標(biāo)板。

確定孵育的溫度，應(yīng)避免溫度的變化。

使用了被污染的試劑

檢查試劑是否被污染。

標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本制備方法不規(guī)范

檢查標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本的制備，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按說明書進行復(fù)溶和稀釋。低溫貯存的標(biāo)本避免反復(fù)凍融，嚴(yán)禁使用溶血標(biāo)本。樣品用 NaN3防腐,抑制了酶的反應(yīng)

顯色底物制備不規(guī)范

檢查底物的制備，如體積是否正確，混合是否恰當(dāng)充分。

檢測時間不當(dāng)

是否在規(guī)定的時間內(nèi)檢測。

儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配。

儀器是否設(shè)定正確，濾光片的使用等。

高背景（本底）

洗滌操作不規(guī)范

洗板不充分，使用手工洗板常出現(xiàn)。最好使用洗板機，或使用洗瓶洗滌。每孔應(yīng)完全充滿洗滌緩沖液，傾出時應(yīng)迅速。若使用洗板機，應(yīng)校準(zhǔn)并設(shè)定足夠充滿每孔的體積量。板的內(nèi)側(cè)不應(yīng)接觸設(shè)備。檢查每孔是否有殘留的洗液或每孔加樣量的體積是否準(zhǔn)確。在兩次洗板之間加30秒的浸泡。

實驗中孵育溫度和時間不適當(dāng)

確定每一實驗步驟的孵育溫度和時間是否適當(dāng)

酶加量過多

加酶前驗看移液器調(diào)節(jié)量是否準(zhǔn)確。檢查稀釋度，若必要進行效價測定。

封閉不完全

檢查封閉液的計算量；提高封閉時間。

標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品中的干擾物質(zhì)

做適當(dāng)?shù)膶φ?/p>

顯色劑受光照時間較長,或污染

顯色劑A和B應(yīng)于使用前10分鐘從冰箱取出

整批樣品放置時間過長,樣品污染

樣品應(yīng)保持新鮮,或低溫保存,防止污染

緩沖液污染

制備新鮮的緩沖液

吸頭重復(fù)使用,未洗凈或消毒不完全而用于加酶或顯色劑

吸頭盡可能一次性使用

太多的信號：全部的板子變成規(guī)則的藍色

不充分的洗滌/洗滌步驟被遺漏-沒結(jié)合的過氧化物酶仍有殘留。

最好使用洗板機充分洗滌檢查孔內(nèi)是否有殘留的洗液或加樣量是否準(zhǔn)確。

底物溶液混合太早并轉(zhuǎn)成藍色

應(yīng)控制底物混合的時機并立即使用

太多的酶結(jié)合物

檢查稀釋度，必要時進行效價測定

封板膜或試劑容器被重復(fù)使用，導(dǎo)致HRP殘留，使TMB底物產(chǎn)生非特異藍色。

使用新鮮的封板膜，每步使用不同的試劑容器

緩沖液中污染金屬或HRP

制備新鮮緩沖液

高CV值（CV：coefficient of variation），花板

操作不慎或洗滌不充分

按說明書洗板、加樣、顯色。洗板尤為重要，如上所述

出現(xiàn)干板，沒有使用封板膜、封板膜重復(fù)使用

確定每兩步驟間，酶標(biāo)板應(yīng)保持濕潤。使用封板膜封口，注意每步使用新鮮的封板膜。

由于操作失誤或板子質(zhì)量差（結(jié)合不均勻）造成包板不均勻。

稀釋用的PBS中不要加其它蛋白檢查包被和封閉液體積、時間和試劑加入的方法。 

檢查所使用的酶標(biāo)板，使用ELISA板子（不要使用組織培養(yǎng)板）

移液器不準(zhǔn)確，吸頭重復(fù)使用。

檢查并校準(zhǔn)移液器。每次取樣必須換吸頭。回顧標(biāo)本的加入步驟，確保每次加樣的準(zhǔn)確性，保證吸取的液體按所設(shè)定的體積吸入和排出，連續(xù)加樣時注意檢查吸頭，確保所加液體的體積。

樣品離心處理不全,反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細(xì)胞成分

標(biāo)本充分離心, 3000rpm 6分以上，嚴(yán)禁使用凝血（溶血）的標(biāo)本

緩沖液污染

制備新鮮的緩沖液

標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到，但兩點之間區(qū)別很差（低或平的曲線）

酶結(jié)合物不足

檢查稀釋度，必要時進行效價測定

捕獲抗體沒有很好結(jié)合到板上

檢查所使用的酶標(biāo)板，使用ELISA板子（不要使用組織培養(yǎng)板）稀釋用的PBS中不要加其它蛋白

檢測抗體不足

檢查稀釋度，必要時進行效價測定

板子顯色不足

延長底物孵育實驗使用推薦品牌的底物溶液

操作不慎

回顧ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序。

標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋度計算有誤

核查計算的情況，制備新的標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線很好，但是沒有任何期望的陽性信號產(chǎn)生

在標(biāo)本中無相應(yīng)的細(xì)胞因子

使用內(nèi)參對照重復(fù)實驗，重新考慮實驗的相應(yīng)參數(shù)

標(biāo)本基質(zhì)遮蓋檢測

將標(biāo)本至少做1∶2相應(yīng)的稀釋，或進行系列稀釋觀測它的恢復(fù)性

標(biāo)準(zhǔn)曲線很好，但是標(biāo)本的判讀值很高

標(biāo)本中含的細(xì)胞因子水平超過實驗范圍

將標(biāo)本做稀釋并再次實驗

當(dāng)使用HRP酶結(jié)合物時，TMB底物加終止液后顯綠色

孔中的試劑顯色不充分

輕輕振蕩板子

邊緣效應(yīng)

工作環(huán)境溫度不均衡

避免將板子在變化溫度環(huán)境中孵育

漂移

實驗過程中出現(xiàn)間斷

整個實驗應(yīng)連續(xù)操作：在實驗開始前將所有標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本做適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)備

試劑沒有按說明書平衡至室溫

在所有試劑加入孔前，確保它們已平衡至室溫，除非說明書中有另外的要求。

是否可更改試劑盒  所提供的實驗操作步驟？

一般廠商為確保最高的靈敏度和特異性，對試劑盒都進行了優(yōu)化，為確保每一試劑盒實驗的規(guī)范性應(yīng)按說明書操作。

是否可混用不同試劑盒中的試劑？

不行。絕大多數(shù)試劑在每批試劑盒中是特異的，若有問題可與廠家或代理商聯(lián)系。

是否可增加或減少標(biāo)本的體積。

商品化的試劑盒所需加入的標(biāo)本體積是優(yōu)化的，應(yīng)按說明書操作，不建議更改所加標(biāo)本的體積。

是否可重確定自己的標(biāo)準(zhǔn)曲線的點？

可以。說明書上有建議的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度，可改變稀釋倍數(shù)和增加曲線的點，但是必須在實驗范圍內(nèi)，高于試劑盒中最高標(biāo)準(zhǔn)品的點和低于靈敏度以下的點是無效的。