關于細菌細胞壁結構，尤其G⁺/G^-菌不同之處見下圖所示：

      由以上結構模式圖可以發現，G⁺菌與G^-­菌有不同之處，其中對于G^-­菌來說：  

細胞壁較薄，厚約10－15nm，結構也較復雜。肽聚糖含量低，僅占細胞干生10％左右，層薄又較疏松，因肽聚糖之間僅四肽側鏈直接聯結，缺乏五肽橋；肽聚糖居于細胞最內層，外面由內向外還有脂蛋白，外膜和脂多糖的三層聚合物。  

（1）脂蛋白（lipoprotein）  由類脂和蛋白質構成，聯結在外膜與肽聚糖層之間，類脂一端經非共價鍵聯結到外膜的磷脂上，另一端由共價鍵聯結到肽聚糖肽鏈中的二氧基庚二酸  殘基上，使外膜和肽聚糖層構成一個整體。  

（2）外膜（outer  membrane）  是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要結構，位于肽聚糖的外側，其結構類似細胞膜，為液態的磷脂雙層，其中鑲嵌一些特異蛋白質，穿透外膜的內外雙層，呈液態鑲嵌體。外膜中間有微小孔道，容許水溶性的小分子通過，以進行細胞內外的物質運輸和交換。除此之外，外膜還能防止胰蛋白酶和溶菌酶等進入，起到保護性屏障作用。（3）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）  由多糖O抗原、核心多糖和類脂A(lipid  A)組成（圖1-8），位于最外層。多糖O抗原向外，由若干個低聚糖的重復單位組成的多糖鏈，即革蘭氏陰性菌的菌體抗原（O抗原），有特異性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脫氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonic  acid,  KDO）等組成，所有革蘭氏陰性細菌都有此結構。類脂A是以脂化的葡萄胺二糖為單位，通過焦磷酸酯鍵組成的一種獨特的糖脂化合物，具有致熱作用，是革蘭氏陰性細菌內毒素的毒性成分。

     一般細菌毒素可分為兩類，一類為外毒素（Exotoxin）；它是一種毒性蛋白質，是細菌在生長過程中分泌到菌體外的毒性物質。產生外毒素的細菌主要是革蘭氏陽性菌。如白喉桿菌、破傷風桿菌、肉毒桿菌、金黃色葡萄球菌以及少數革蘭氏陰性菌。加一類為內毒素（Endotoxin）。是革蘭氏陰性菌的細胞壁外壁層上的特有結構。細菌在生活狀態時不釋放出來，只有當細菌死亡自溶或粘附在其它細胞時，才表現其毒性，內毒素的主要化學成分是脂多糖中的類脂A成分。

細菌外毒素與內毒素性質的比較 

（1）外毒素（exotoxin）   有些細菌在其生命活動過程中產生毒素能釋放到周圍環境中，稱為外毒素。產生外毒素的細菌主要是革蘭氏陽性菌。如白喉桿菌、破傷風桿菌、肉毒桿菌、金黃色葡萄球菌以及少數革蘭氏陰性菌。如痢疾桿菌、霍亂弧菌等。細菌外毒素有以下特點：

①毒性強，如純化肉毒桿菌外毒素結晶1mg可殺死2,000萬只小白鼠，對人的最小致死量約為10^-4mg，破傷風毒素對小白鼠的致死量為10^-6mg，白喉毒素對豚鼠的致死量為10^-3mg。②對機體組織有選擇性的毒性，如白喉桿菌外毒素主要抑制蛋白質合成，特別是影響肽鏈延長，引發心肌炎、腎上腺出血及神經麻痹等；破傷風外毒素主要毒害脊髓前角運動神經細胞，引起所屬肌肉的痙攣強直。  

③具有抗原性，外毒素的化學成分為蛋白質，有抗原性，即以外毒素刺激機體可產生大量的抗毒素，抗毒素能中和外毒素使其無毒。外毒素用甲醛處理后，脫毒變成類毒素，但仍保持抗原性。  

（2）內毒素（exotoxin）   是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分，細菌在生活狀態時不釋放出來，只有當細菌死亡自溶或粘附在其它細胞時，才表現其毒性。內毒素的主要化學成分是脂多糖中的類脂A成分。  

     內毒素的致病作用無特異性，即各種革蘭氏陰性菌對人類引起基本相同的反應。少量內毒素可引起機體發熱反應；大量內毒素進入血液，可使血管透性改變，局部出血，顆粒性白細胞增多或減少和體重下降，嚴懲毒時能導致內毒素性休克。內毒素毒性比外毒素小得多。  

     內毒素是外源性致熱原，它可能激活中性粒細胞等，使之釋放出一種內源性熱原質，作用于體溫調節中樞引起發熱。

      到目前為止，我們知道細菌內毒素作為G^－菌細胞壁外表層結構的一部分脂多糖（lipopolysacch  aride,LPS）主要是由多糖O抗原，核心多糖和類脂A(Lipid  A)三部分組成。見圖所示：  

類脂A位于最多層。多糖抗原向外由若干個低聚糖的重復單位組成的多糖鏈，具有特異性，核心多糖分為內核心及外核心，外核心由數種已糖，包括葡萄糖，半乳糖，乙酰氨基葡萄糖等組成。內核心含有庚糖及特殊的KDO  (3-脫氧-D-甘露糖-辛酮糖)。KDO以不耐酸的酮糖鍵與類脂A的氨基葡萄糖連接。所有G^-菌都有此結構。類脂A是以脂化的葡萄糖胺二糖為單位。通過焦磷酸酯鍵組成的一種獨特的糖脂化合物。具有致熱作用。是革蘭氏陰性細菌內毒素的毒性成分

細菌內毒素生物活性

類脂A作為內毒素生物活性的主要部分。也是近年來研究報道最多的。由氨基葡萄糖，磷酸，10-18碳的長鏈脂肪酸組成，它與可溶性的O-特異性鏈及核心分離后。即有難溶于水的特性。游離后的類脂A?？勺陨砟鄢筛叻肿拥膹秃象w，其分子量大小不等。同時它也含有疏水性的中心及親水性的邊沿。是一種雙相分子，又是酸堿兩性分子，因此類脂A的獨特結構使細菌內毒素具有多種的生物活性。

細菌內毒素不同水平上的生物活性

細菌內毒素的耐熱性

我們知道細菌內毒素除了具有各種生物活性外，還具很強的耐熱性，一般的高壓滅菌不能使其滅活，需250℃30分鐘以上的干熱滅菌才能使其滅活，目前我國藥典熱原檢查法和細菌內毒素檢查法中關于玻璃用具的滅菌處理為180℃2小時或250℃30分鐘以上，而日本藥局方第十三改正為250℃1小時以上。其它各國藥典也大都如此，據國外文獻報導，當對細菌內毒素的稀水溶液，在不同溫度下保溫處理后進行檢測，發現其內毒素活性在200℃1小時時還能檢測出來。而只有當加熱到250℃1小時才能完全滅活，國內細菌內毒素標準品的耐熱情況雖然未能考察，但可以認為對細菌內毒素檢查法中玻璃用具等的除菌最好采用250℃1小時以上的干烤處理。  

細菌內毒素的除去方法

     由于細菌內毒素具有很強的耐熱性，因此對于它的去除采用一般的滅菌方法是無法達到的，尤其是制藥行業注射劑中內毒素的除去，對于臨床用藥的安全性意義重大，因此對于藥品中內毒素去除可以使用過濾及高壓滅菌方法，而對于一般水溶液，則普通采用薄膜過濾后高壓法，對于實驗中所用器具可使用干熱或射線給予滅活，其它也可使用酸、堿破壞的方法。對于細菌內毒素檢查法中所用實驗用具的外源性內毒素除去方法，最好采用250℃2hr以上的干熱滅菌方法。  

     細菌內毒素的生物活性隨外界因素的影響變化很大。目前已經知道。一些金屬離子、超聲波以及溫度等都會對細菌內毒素的生物活性產生很大影響，據國外文獻報導，鐵離子、鋁離子和鎵離子等會引起細菌內毒素活性的降低。因此在試驗過程中最好使用玻璃用具，以必免這些因素，另外溫度的高低對細菌內毒素水溶液活性影響很大，根據國內外文獻的報道：內毒素水溶液活性隨著環境溫度的升高而降低，因此對于內毒素水溶液一定要在低溫處保存，而且對已經稀釋好的內毒素水溶液，要盡可能的在2小時內用完。以免活性降低。

細菌內毒素致病機理

（2）內毒素對糖代謝的影響及其機理
內毒素直接或間接損害肝臟，引起糖代謝紊亂及酶學、蛋白代謝的改變。
①致病機理：脂多糖能刺激腎上腺素的分泌和釋放，使磷酸環化酶活性增強，加速糖分解，使血糖濃度表現為暫時性升高。
②低血糖癥的主要機理：脂多糖進入機體數小時后，始作用于肝細胞，引起肝細胞的損傷，使糖元異生的關鍵酶活性降低，抑制糖原的異生和分解，激活丙酮酸激酶，加速葡萄糖的分解氧化，并產生大量的熱量，在臨床上表現為發燒癥或持續低血糖癥。內毒素致肝臟枯否氏細胞功能受到抑制，進而影響對內毒素的消除及對胰島素的分解代謝。

（3）內毒素對血液循環系統的影響及機理：
內毒素可引起白細胞和血小板減少，激活凝血、纖溶系統，產生出血傾向，可導致彌漫性血管內凝血（DIC）的發生。DIC嚴重時，可導致嚴重的休克癥狀。
①內毒素（脂多糖）對中性粒細胞的作用及機理：內毒素（脂多糖）能引起人體血液中中性粒細胞的增多，這是人體對內毒素反應最敏感的指標之一，亞致熱量即可引起中性粒細胞的減少，并伴之以粘連性增加，數小時后，中性粒細胞明顯增多。
②脂多糖對血小板的影響：對實驗動物注射足量的脂多糖后，均能導致動物血液中血小板明顯減少。
③脂多糖對淋巴細胞的作用：脂多糖作用于B淋巴細胞，可增強B淋巴細胞DNA的合成。脂多糖能提高人體體液免疫功能，革蘭氏陰性菌感染后引發的機體發熱是人體自我防御功能的表現，是積極的。
④脂多糖對單核細胞和巨噬細胞的作用：增強吞噬和巨噬細胞的殺菌能力。同時，脂多糖作用于巨噬細胞和單核細胞后，能產生多種中介物質，參與外源性凝血過程，脂多糖能刺激單核細胞和巨噬細胞產生集落刺激因子（GSF）。
⑤對紅細胞和血清鐵的影響：脂多糖能抑制紅細胞的生成，脂多糖直接作用于骨髓造血干細胞，抑制骨髓的造血功能。內毒素可導致血清鐵濃度的降低，內毒素血癥的另一病癥就是缺鐵性貧血。
⑥內毒素可經C3旁路或經典途徑激活補體系統，最終導致血壓下降和血液動力學的改變，出現局部或全身性shwartzman（炎癥癥狀），并伴有輕微的發熱癥狀。

(1-3)β-D-glucan概念、結構及活性

1)   (1-3)β-D-glucan概念：
(1-3)β-D-glucan在自然界的分布很廣，主要存在于擔子菌、真菌、地衣類、高等植物以及酵母、藻類的菌體成分中，平均分子量在6800左右。分子結構具用多樣性。另外，某些使用人造纖維制作的人工腎透析模上也含有類似物質。但它并不引起家兔的升溫過程。關于(1-3)β-D-glucan旁反應系是否可以單獨形成凝固蛋白，或是與ET反應系的共同作用形成凝固蛋白，目前國外學者尚有一定分歧。(1-3)β-D-glucan對熱極為穩定，高壓121、1小時不以使其全部滅活。需250℃2小時干熱滅菌處理才能徹底去除。另外強酸、強堿以及一些酶類也能使其滅活。目前在日本，尤其是在藥局方的各種解說書中，無熱原的概念即滅菌后的用具除了無ET外，還要求無(1-3)β-D-glucan。這一點要引起足夠重視。
2)   (1-3)β-D-glucan結構：
由上可知：(1-3)β-D-glucan在自然界的分布很廣，可以說明它同細菌內毒素一樣，無處不在，無處不有。有關它的化學結構如下所示：
                            
除此之外，它還有許多其它高一級的結構，如(1-4)β-D-glucan、(1-6)β-D-glucan結構等。
3)   (1-3)β-D-glucan生物活性：
(1-3)β-D-glucan與細菌內毒素一樣，除了結構的多樣化外，它們也有許多共同特性。如對熱的穩定性，不易去除，不同菌株所產生的結構差異性等。作為(1-3)β-D-glucan的生物活性主要表現在以下幾個方面：
(1-3)β-D-glucan類的生物活性：
1.刺激機體的（MQ）巨噬細胞產生各種細胞分裂素Cytikines(TNF  IL-1  IL-6等)；
2.激活補體第二條經路；
3.抗腫瘤作用；
4.抗炎癥作用；
5.抗放射線作用；
6.激活G因子旁路使鱟血細胞裂解液（LAL（TAL）試劑）產生凝集反應

     作為內毒素的研究和使用者對于高純度的內毒素標準品的渴望是十分迫切的，我們知道，細菌內毒素的活性隨著菌株來源不同，調制方法及分散狀態等不同差異很大，因此作為一個好的標準內毒素必須有滿足以下條件：

1）     菌株來源要有很好的穩定性。

2）     能夠很好地確定其化學分析值。

3）     強的發熱性與鱟試驗活性間要有很好的相關性。

4）     反應曲線為直線型。

5）     易溶、在凍冷狀態下能長時間穩定貯存。

6）     高純度并能保證供應。

WHO在1950年開始就提出了熱原標準品的問題，在1959年Shigella  dysenteriae內毒素第一次作為WHO  standard被采用由于這個標準品穩定性等問題，目前已不在使用，之后，隨著內毒素的研究，尤其是鱟試驗法的研究與應用，各種新的內毒素標準品已被制備出來，目送各國在內毒素標準品菌株的選擇上，一般均使用發熱活性比較強的大腸桿菌，除添加附形劑稍有不同處，其對家兔的性幾乎都是一樣的，各種內毒素標準品，除了發熱性好外，還要求具有鱟試驗活性，化學分析值安定性、均一等。目前WHO最新的細菌內毒素標準品為EC－6，      以下為三國標準內毒素化學分析值，供參考：

     細菌內毒素工作標準品：主要用于日常檢驗工作和實驗研究，尤其在內毒素檢查法中，用于陽性對照和樣品的陽性對照，其力價要比參考內毒素標準品要低的多。由于制備工藝不同其對鱟試劑的反應性也存在很大差異，因此在實驗中，為了保證實驗有效和準確建立穩定統一的CSE是十分必要的。

另外，目前的內毒素標準品一般都是針對凝膠法而言的，雖說國外在定量法使用上已逐漸增多，但真正的定量法專用內毒素標準品還沒有，因此定量法中使用的內毒素標準品的研究是十分重要的。

細菌內毒素量值

     關于細菌內毒素的量值在80年代幾乎都是以重量單位來表示它很不科學，相同重量的內毒素，由于菌株來源不同，提取方法各異而且所加附形劑不同，因此其生物活性相差很大。如EC-2和EC-5，其重量換算單位分別：5EU/ng  和10EU/ng，因此隨著人們對內毒素生物活性的不斷提高，以效價單位表示內毒素的量值是十分合理的。

     目前，世界各國藥典所收載的細菌內毒素標準品均是以效價單位來表示。由于各國所用菌種來源不同，加入的賦形劑不同，其效價也不盡相同，如美國藥典內毒素參考標準品（EC-6）的效價為10000EU/瓶，JP為16000EU/瓶，BP=WHO為14000EU/瓶，而中國藥典內毒素參考標準品（Lot;981）的效價為9000EU/Amp。因此，建立統一的細菌標準品是目前各國所面臨的一大問題。

　　內毒素血癥是由于血中細菌或病灶內細菌釋放出大量內毒素至血液，或輸入大量內毒素污染的液體而引起。內毒素血癥分為內源性和外源性兩大類。
（1）  內毒素血癥發生的原因。
在嚴重創傷、感染等應激狀態下可出現：
全身網狀內皮系統功能障礙，免疫機能下降，腸道吸收的內毒素過多而超過機體清除能力；
胃腸道粘膜缺血、壞死、屏障破壞，大量內毒素釋放入血；
腸道吸收的內毒素因肝功能障礙由側枝循環直接入體循環；
某些組織、器官的感染引起外源性內毒素入血。
（2）內毒素血癥的臨床癥狀
內毒素血癥臨床癥狀主要決定于宿主對內毒素的抵抗力。癥狀和體征有：發熱，白細胞數變化，出血傾向，心力衰竭、腎功能減退、肝臟損傷、神經系統癥狀，以及休克等。內毒素可引起組胺、5-羥色胺、前列腺素、激肽等的釋放，導致微循環擴張，靜脈回流血量減少，血壓下降，組織灌流不足，缺氧及酸中毒等。
（3）內毒素血癥的后果
內毒素血癥可以出現在多系統的多種疾病中，通常導致致死性感染性休克、多器官功能衰竭、彌漫性血管內凝血等，病死率極高。
內毒素血癥可引起一系列病理生理改變：①發熱反應：內毒素直接作用于下丘腦體溫調節中樞，或作用于白細胞使之釋放內原性致熱原；②促使血管活性物質如緩激肽、組胺、5-羥色胺、血管緊張素等釋放，使血壓下降，導致微循環障礙；③引起白細胞和血小板減少，激活凝血、纖溶系統，產生出血傾向；彌漫性血管內凝血；④經C3旁路或經典途徑激活補體；⑤直接或間接損害肝臟，引起糖代謝紊亂及酶學、蛋白代謝的改變；⑥激活白三烯、前列腺素、巨噬細胞、單核細胞及內皮細胞活性。
（4）各類疾病內毒素血癥的發生率
急性肝炎37-64%；爆發性肝炎58-100%；丙肝61.54%；膽石癥伴急性梗阻性化膿性感染85%；燒傷85%；敗血癥70%；多器官功能衰竭100%；急性胰腺炎90%；皮膚軟組織感染70-81.1%；腹腔感染72-84%；尿路感染70-80%（腎炎）、癌癥70%；肺炎100%；上感100%。
（5）內毒素血癥的治療
內毒素血癥的治療原則多主張：①減少內毒素的產生和吸收；②改善內毒素引起的微循環障礙。

腸源性內毒素血癥
許多非革蘭氏陰性菌感染的重癥病人及處于應激狀態的患者，絕大部分出現內毒素血癥，血漿中內毒素血癥主要來源于腸道內毒素的吸收，因此腸源性內毒素血癥是病人死亡的主要原因。
腸源性內毒素血癥的發病機制與如下幾方面有關：
（1）腸道內毒素生成和攝取增多（腸道微生物移位）
機體免疫功能受損和腸粘膜免疫屏障的破壞，內毒素移位，進入血循環；
腸粘膜屏障功能障礙，粘膜缺血、萎縮、破損、脫落均可造成內毒素移位，發生腸源性內毒素血癥；
腸道微生態環境破壞，廣譜抗生素的長期應用減少了對抗生素敏感的厭氧菌的數量，導致革蘭氏陰性菌大量繁殖，突破粘膜屏障而移位進入血循環。
（2）肝臟對內毒素的清除功能減退，大量內毒素在肝臟未經解毒溢入體循環。
（3）門體系統功能障礙，出現門體分流，來自腸道的內毒素繞過肝臟，未經滅活解毒，涌入體循環，形成內毒素血癥。
（4）淋巴液生成增加，腹腔淋巴管--胸導管是內毒素進入體循環的重要替代途徑。
（5）外周血內毒素滅活功能降低，各種原因造成的外周血滅活內毒素能力下降，易發生腸源性內毒素血癥。

鱟的種屬及分布

　   鱟，又稱作王蟹，是一種棲生于海洋中的低等無脊椎動物，大約出現在古生代泥盆紀，距今已明幾億年的歷史，但直到現在它的形態并無重大變化故有＂活化石＂之稱，在國外普通受到保護。  

     鱟試劑，即利用美州鱟或新鱟的血細胞裂解物提取而來，分別為  LAL試劑和TAL試劑兩種

     鱟，在動物學分類上，隸屬于節肢動物門（Arfhropoda），有螯肢亞門（chelicerata），肢口綱（Merostomata），劍尾目（Xiphosura）。出現在4億年前的古生代泥盆紀俗稱＂活化石＂，鱟是從古生代的三葉蟲演化而來。

     鱟的種屬很少，目前全世界僅存三屬4種，分別為：

1.  美洲鱟   Limulus  polyphemus  LinnaEUs分布在北美西洋岸

2. 東方鱟TachyplEUs  tridentatus  Leach分布在中國、日本、菲律賓等

4.  園尾鱟  Car  cinoscorpius  rotundi  cauda  pocock分布馬來半島、印尼等

     其中能夠用于制備鱟試劑的主要有：1.美洲鱟和  2.東方鱟。

鱟試劑的制備

對于生產過程要嚴格按照無菌操作進行。

     隨著鱟試劑制備工藝的不斷完善，以及生物化學的發展，人們已逐漸認清了鱟試劑中各種組份，并已分離提取出來，到目前為止，鱟試劑中的主要組份包括有：C.B.G.凝固原，凝固蛋白酶以及適量的Ca^z  +Mg⁺Na⁺等。  

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