01、什么是qPCR

定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR），作為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性技術(shù)，憑借其高精確度和準(zhǔn)確性，已對生物醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。

作為經(jīng)典PCR技術(shù)的的高級形式，qPCR，也被稱為實(shí)時(shí)熒光定量PCR，利用了新合成DNA鏈中特定染料的熒光信號增強(qiáng)，或是針對特定DNA序列的探針釋放的熒光片段，來監(jiān)測DNA的互補(bǔ)過程。這一技術(shù)的核心優(yōu)勢在于，它能將DNA的檢測與擴(kuò)增過程相結(jié)合，即時(shí)為科研人員提供重要的數(shù)據(jù)信息。

qPCR和傳統(tǒng)PCR的基本操作原理相似，即通過DNA聚合酶催化DNA的補(bǔ)充，將新的標(biāo)記序列添加到短的單鏈DNA片段上，即引物的3'-OH斷裂。以這一系列反應(yīng)在配備有熒光檢測系統(tǒng)的專用熱循環(huán)儀中進(jìn)行。通過測量熒光信號強(qiáng)度，將其與預(yù)設(shè)的閾值或標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，從而實(shí)現(xiàn)DNA含量相對或絕對定量分析。

02、qPCR應(yīng)用領(lǐng)域

qPCR憑借其實(shí)時(shí)監(jiān)測、高靈敏度與特異性，能夠?qū)崿F(xiàn)對遺傳物質(zhì)極為精準(zhǔn)的測量，并在多個(gè)領(lǐng)域中具有不可估量的應(yīng)用價(jià)值。

1. 基因表達(dá)譜分析：qPCR技術(shù)能夠定量特定基因在不同條件下的表達(dá)水平，為揭示基因功能、調(diào)控機(jī)制及疾病發(fā)生發(fā)展過程中的基因表達(dá)變化提供依據(jù)。

2. 病原體檢測：qPCR能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出微量的病原體DNA或RNA，為疾病的早期診斷、疫情監(jiān)控及治療效果評估提供支持。

3. 遺傳變異研究：利用qPCR技術(shù)，科研人員能夠檢測并分析遺傳序列中的單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入/缺失變異等遺傳變異，為遺傳病篩查、個(gè)性化醫(yī)療及藥物研發(fā)等領(lǐng)域的研究提供信息。

4. 環(huán)境監(jiān)測：qPCR能夠高效檢測水體、土壤及空氣中微生物群落的變化，評估環(huán)境質(zhì)量，監(jiān)測污染源的生態(tài)影響，為環(huán)境保護(hù)和治理提供依據(jù)。

5. 臨床診斷：qPCR已成為多種疾病診斷、預(yù)后評估及治療效果監(jiān)測的重要手段。通過檢測患者體內(nèi)特定基因或病原體的表達(dá)水平，醫(yī)生能夠制定更加精準(zhǔn)的治療方案。

03、qPCR 的工作原理

qPCR反應(yīng)的核心開始于一個(gè)混合體系，該體系包含了DNA聚合酶、脫氧核苷酸三磷酸酯（dNTPs，作為DNA合成的原料）、特定設(shè)計(jì)的引物（用于識別并啟動(dòng)DNA鏈的延伸）、熒光染料或報(bào)告探針（用于實(shí)時(shí)監(jiān)測DNA擴(kuò)增過程），以及待檢測的模板DNA。

04、qPCR 的關(guān)鍵步驟

變性階段：在高溫條件下（常規(guī)設(shè)定為94°C至98°C之間），雙鏈DNA解開成單鏈DNA。

退火階段：在溫度稍低的環(huán)境中（大約50°C至70°C之間），使設(shè)計(jì)的引物與模板DNA中的目標(biāo)區(qū)域相結(jié)合，形成引物-模板DNA復(fù)合物。

延伸階段：在DNA聚合酶的催化作用下，溫度調(diào)至酶活性的范圍（通常在68°C至72°C之間），酶沿著引物結(jié)合的起點(diǎn)，以模板DNA為模板，逐個(gè)添加核苷酸，產(chǎn)生兩條互補(bǔ)的 DNA 鏈，形成雙鏈DNA。

定量完成階段：在每一輪DNA補(bǔ)充時(shí)，通過熒光計(jì)測量并記錄這些熒光信號，以做定量分析。

05、qPCR 檢測方法

常見的qPCR檢測方法包括DNA插層染料、水解探針、分子信標(biāo)和LNA探針。

06、qPCR的引物設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)

引物的設(shè)計(jì)長度推薦在15至30個(gè)堿基對之間，這樣有助于70至200個(gè)堿基對的目標(biāo)序列進(jìn)行高效互補(bǔ)。

為確保PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行，所選用的正向和反向引物應(yīng)具有相近的熔解溫度（Tm），理想范圍設(shè)定在60°C至65°C之間。

引物的3'端應(yīng)充足GC，可以提升引物與模板DNA結(jié)合的效率和提高熔解溫度。引物的GC含量應(yīng)控制在40%至60%之間，以達(dá)到最佳的擴(kuò)增梯度、穩(wěn)定性和擴(kuò)增效率。

退火溫度通常建議比引物的Tm值低約5°C，這樣做是為了減少非極化的可能性。

07、qPCR常見問題及解決方法

問題1.qPCR 擴(kuò)增效率低

問題原因：

試劑與反應(yīng)體系因素：如試劑降解、過期或保存不當(dāng)導(dǎo)致的活性降低。或者加液量不足或成分比例不當(dāng)而導(dǎo)致效率低。

引物與標(biāo)記設(shè)計(jì)問題：引物和熒光標(biāo)記（或探針）的設(shè)計(jì)存在缺陷。包括引物與模板DNA的結(jié)合力不夠強(qiáng)、引物間形成二聚體、產(chǎn)物長度過長以及未能充分優(yōu)化反應(yīng)條件。

解決方法：

保證所有qPCR試劑質(zhì)量良好，嚴(yán)格按照說明書儲存和使用。確保加液量準(zhǔn)確無誤，以減少操作誤差。

利用文獻(xiàn)資源或?qū)I(yè)設(shè)計(jì)軟件重新設(shè)計(jì)引物和標(biāo)記。以確保產(chǎn)物長度控制在80到150堿基對之間，同時(shí)，根據(jù)引物的特性調(diào)整和優(yōu)化PCR反應(yīng)條件。

  問題2：結(jié)果出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象

問題原因：

試劑與反應(yīng)體系因素：可能試劑或模板受到污染，此外，反應(yīng)體系中鎂離子濃度過高或引物濃度過高等原因?qū)е?/span>，也可能產(chǎn)生假陽性。

設(shè)計(jì)問題：引物設(shè)計(jì)存在缺陷，不恰當(dāng)?shù)囊镄蛄锌赡軐?dǎo)致引物間形成二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，影響PCR后續(xù)的反應(yīng)的進(jìn)行，最終表現(xiàn)為假陽性結(jié)果。

解決方法：

嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程，人群小心操作試劑或模板的污染。

一旦發(fā)現(xiàn)污染情況，應(yīng)立即排查并處理，必要時(shí)更換受污染的試劑或者模板。

在引物設(shè)計(jì)完成后，用專業(yè)的軟件進(jìn)行驗(yàn)證，確保避免引物之間的二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。

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