陳連旭 綜述 于長隆審閱
北京大學運動醫(yī)學研究所，北京100083
摘要：RNA干涉(RNA interference)是指由特定雙鏈RNA（dsRNA）引起的轉錄后基因沉默現(xiàn)象,是目前分子生物學、細胞生物學和遺傳學的研究熱點，為人們研究基因功能提供了一個有力工具。siRNA(small interference RNA)是RNAi的起始誘導物，在細胞內引起強烈的RNAi,降解目的基因的mRNA，以控制目的基因的表達。轉錄因子NF-kB是介導許多免疫和炎癥的中心物質 ，在介導骨性關節(jié)炎形成的許多細胞因子中，發(fā)揮關鍵的作用 。本文只在回顧近來在RNAi,NF-kB和骨性關節(jié)炎中細胞因子的研究進展，探討RNAi技術應用骨性關節(jié)炎的治療。
關鍵詞： siRNA；NF-kBp65；基因治療；骨性關節(jié)炎；細胞因子
一、RNAi技術
RNA是生物體內最重要的物質基礎之一，它與DNA和蛋白質一起構成了生命的框架。最近因其能干涉生物基因表達而頗受矚目，并且由此而引發(fā)的RNA干擾。RNAi(RNA interference)即RNA干擾，自從1998 年被闡明以來，一直是分子生物學、細胞生物學和遺傳學的研究熱點。從植物、真菌到線蟲乃至哺乳動物和人類，RNAi研究方興未艾。
RNAi的發(fā)現(xiàn)
早在10多年前，植物學家在研究轉基因植物時就發(fā)現(xiàn)，部分外源基因導入植物后，不但未能正常表達，植物自身的等位基因表達也受到抑制，即所謂共抑制（cosupression）現(xiàn)象。此后，在酵母菌和線蟲研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，稱之為緩解（quelling）。這種基因抑制是發(fā)生在轉
錄后水平的，因此又稱為轉錄后基因沉默(post-transcription gene silencing PTGS)[1]。Fire等［2］在利用反義RNA進行線蟲基因阻斷時，發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA能夠引起mRNA降解，而且這一效應是基因特異性的。此后，越來越多研究證實，共抑制、緩解和轉錄后基因沉默，都存在由雙鏈RNA 介導mRNA降解的共同機制—-在生物體內，當外源性或內源性雙鏈RNA（double-stranded RNA dsRNA）進入細胞后，識別含有其互補序列的RNA并與之結合后，在酶的作用下降解mRNA，從而干擾相應基因表達。Fire將這一現(xiàn)象稱為RNA interference(RNAi)。這是一種廣泛存在于生物界的古老的現(xiàn)象，早在動植物分化之前的生物體內就已經產生了。RNAi在生物抵御病毒感染，維持基因組中轉座子的穩(wěn)定以及某些生物生殖細胞的發(fā)育過程中都起著重要作用。
RNAi的分子機制
隨著研究的深入，科學家對于RNAi的發(fā)生機制已達成了初步共識：外源性（如病毒）或內源性的dsRNA在細胞內與一種RNA酶3（RNAase 3 endonucleasee）—Dicer結合，隨即被切割成21-23 nt的，帶有3’端單鏈尾巴及磷酸化的5’端的21-23 nt的短鏈dsRNA，是RNAi的起始誘導物，即siRNA（small interference RNA）。siRNA與Dicer形成RISC復合體（RNA induced silencing complex)。siRNA作為引導序列，按照堿基互補原則識別靶基因轉錄出的mRNA，并引導RISC復合體結mRNA。隨后siRNA與mRNA在復合體中換位，核酸酶Dicer將mRNA切割成21-23 nt的片段，特異性地抑制靶基因的表達。而新產生的雙鏈RNA片段可再次形成RISC復合體，繼續(xù)降解mRNA，從而產生級聯(lián)放大效應。因此，每個細胞只需要幾個siRNA分子就能夠引起強烈的RNAi效應[3]。此外，siRNA還可以在RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase RDRp）的作用下進行大量擴增，并轉運出細胞，使siRNA擴散到整個機體并可以傳代[4]。
RNAi作用機制示意圖：
RNAi與基因功能研究
人工誘導RNAi技術的建立，為人們提供了一種高效的基因功能研究方法。有人將綠色熒光蛋白基因（green fluorescent protein GFP）導入斑馬魚胚胎后，通過顯微注射將針對GFP序列的dsRNA注入細胞，結果GFP基因受到抑制，而同時轉入的其他基因不受影響。注入針對控制脊索或眼睛發(fā)育基因的dsRNA后，胚胎發(fā)育成無尾或無眼的斑馬魚。這說明在脊椎動物中，內源和外源性基因都可以被其同源的dsRNA特異性抑制，并產生基因缺失表型。Tuschl實驗組將體外構建的dsRNA分別導入Hela細胞（人類宮頸癌細胞）、大鼠成纖維細胞和小鼠3T3細胞，分別抑制了哺乳動物LaminB1,LaminB2,NUP153,GAS41,ARC21,cdk1,b-actin和r-actin，等21個不同類型基因，均獲得成功，并重新界定了部分必須基因和非必須基因[5]。RNAi抑制作用有嚴格的序列特異性，即使一個堿基的錯配，也會嚴重影響抑制效果。與傳統(tǒng)的基因功能的研究方法相比，RNAi技術靈敏、可靠、結果穩(wěn)定，操作便捷，費用相對較低，很適合用于大規(guī)模篩選，定位新的功能基因。
哺乳動物細胞中的RNAi研究
RNAi技術已成為生物基因功能研究有力工具。然而在哺乳動物細胞中，超過30nt的dsRNA會啟動一種自身細胞毒機制，使大量mRNA非特異性降解，引起細胞死亡。為了克服這一障礙，Tuschl和他的同事將體外合成含有19個堿基對和2-3 nt的3’端單鏈尾巴的短鏈siRNA，通過脂質體轉染，導入哺乳動物細胞后，成功誘導RNAi。但是，在一些類型的細胞中，只能對靶基因產生瞬時抑制效應[6]。于是學者們構建了的以DNA為模板的siRNA表達載體。將19nt的目的序列及其反向重復序列插入含有啟動子質粒染色體，同時插入作為檢測標志的報告基因（reportor）如GFP。該表達載體轉染細胞后，能夠轉錄出含有19個堿基對的莖環(huán)狀（發(fā)夾狀）siRNA,誘導RNAi，有效抑制目的基因[7]。表達載體的方法將合成siRNA的過程轉移至細胞內進行，不但效率大大提高，而且可以排除RNA酶的干擾，延長siRNA的半衰期[8]。更重要的，隨著載體質粒的復制、擴增，siRNA擴散到整個機體，基因抑制效果能夠傳代。這一方法的應用，使siRNA技術應用，進入了新階段。
siRNA與基因治療
與基因替代、反義寡核苷酸治療、細胞因子基因治療等傳統(tǒng)的基因治療方法相比，siRNA技術有著無可比擬的優(yōu)勢。首先，RNAi基因抑制效果確切。微量的siRNA即可使其編碼致病基因產物的含量下降90%以上，達到剔除（knock-out）的效果。其次，RNAi抑制具有嚴格的序列特異性，治療的針對性強，副作用小。在抗病毒研究中，Lee等[9]在HVI-1病毒基因組的rev和tat基因中分別選取21nt的序列為靶點，進行RNAi抑制，5d后檢測HVI-1的p24抗原下降達90%，細胞的生長未受影響。針對脊髓灰質炎病毒和丙型肝炎病毒的體外RNAi抑制實驗，也可以顯著降低培養(yǎng)人類細胞中的病毒滴度。美國冷泉港實驗室的McCaffray AP 研究組，第一次在活體大鼠體內成功誘導了RNAi，使其肝臟內的HCV含量平均下降81%[10]。腫瘤是多基因、多因素疾病，單個癌基因的抑制往往很難達到治療效果。RNAI技術能夠同時抑制多個不同基因,而且抑制效果互不干擾。此外，RNAi識別可以精確到一個核苷酸，對由野生型點突變形成的癌基因，如ras，p53等，能夠產生準確有效的封閉效果，野生型基因則不受影響。實驗證明，bcl-2，CDK-2，PLK-1,p53等腫瘤相關基因的RNAi抑制，能夠使人類宮頸癌細胞（hela）增殖速度減慢，惡性程度降低，凋亡加快。肝癌（Hep3B）、非小細胞肺癌（HI299）、頭頸部鱗狀細胞癌（C33-A）、骨肉瘤（U-2OS）及前列腺癌（LNCaP）[11]、白血病[12]等細胞系中的實驗也發(fā)現(xiàn)類似效應。此外，將RNAi應用于wils0on病等先天遺傳性疾病的體外實驗也獲得令人滿意的結果[13]。H.W.Zhou等[14]利用siRNA技術在骨性關節(jié)炎的軟骨細胞抑制p16基因，獲得滿意效果，這也是首次在軟骨細胞中應用RNAi技術，提示我們可以在骨科領域應用RNAi技術。
二、核因子kappaB
核因子kB(nuclear factor kappaB,NF-kB)是1986年由Sen和Baltimore首次從B淋巴細胞中監(jiān)測到的一種能與免疫球蛋白k輕鏈基因增強子kB序列特異結合的核蛋白因子[1]。NF-kB是普遍存在于真核細胞中的一種快反應轉錄因子，在靜息狀態(tài)下與抑制性蛋白IkB結合并以非活性狀態(tài)存在于胞漿內。抑制狀態(tài)的NF-kB對環(huán)境變化比較敏感，可被多種刺激激活，轉入核內調節(jié)一系列基因的表達。NF-kB對大量基因的調節(jié)，在機體的正常生理狀態(tài)和各種疾病的病理發(fā)生機制都發(fā)揮著重要的作用。它不僅參與機體正常的免疫和炎癥反應、發(fā)育、細胞的生長和調亡過程，同時它與癌癥、關節(jié)炎、哮喘、心血管疾病也有密切的聯(lián)系。
NF-kB的結構
NF-κb是屬于Rel家族的二聚體蛋白，具有300核苷酸的同源結構域：Rel同源結構域(Rel Homology Domain,RHA)，內含DNA結合域、二聚化結構域和核定位信號（nuclear translocation signal,NLS）區(qū)，分別具有與DNA上的kB序列結合，與同源或異源亞基形成二聚體，與NF-kB抑制蛋白IkB家族成員相互結合等功能。大多數(shù)二聚體包括P65（Rel A）和P50兩種蛋白，其他Rel家族的蛋白如：c-ReL,Rel B、v-Rel、P52也有可能以不同的方式跟它結合。不同形式的二聚體可能選擇激活不同的基因，具有不同的轉錄活性。RelA、RelB和c-Rel的C端含有轉錄激活域（transactivation domain）,其中富集絲氨酸、酸性氨基酸和疏水性氨基酸，能直接作用與轉錄元件而激活轉錄過程，而p50和p52無此結構。NF-kB/Rel蛋白家族均以同源或異源二聚體形式存在，其中以p50/RelA最普遍，幾乎存在于所有的細胞中。p50亞基用于與DNAkB序列結合，而RelA亞基即可利用其C端的轉錄激活域增強靶基因的轉錄激活，又可與各種Ikb成員直接藕聯(lián)[2]。
IkB抑制蛋白家族包括IkBa、IkBb、IkBr、IkBe、p100、p102、Bcl-3和IkB-R[3]。其中IkBa和IkBb時NF-κB活性的主要調節(jié)者。它們享有三個共同的結構特征：都有一個N末端調節(jié)域，與信號誘導的IκB蛋白降解有關；都有6個獲7個錨定蛋白重復區(qū)，可與RHD結合而隱藏NF-kB的NLS,從而阻止NF-κB的核移位；IκB的C端富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的羧基末端片斷（PEST）基序，該基序在抑制NF-κB與DNA的結合中發(fā)揮作用。
NF-κb正常情況下跟阻滯蛋白IκB結合，以非活性方式存在與細胞質中，IκB分子具有ankryn樣的重復序列，同不同的Rel蛋白結合，覆蓋核轉錄信號位點。當有外源激活信號時，通過一系列酶的作用,IκB磷酸化，脫離多聚體，而使NF-κB暴露轉錄位點而進入核內，結合到Rel蛋白的順式作用結合位點（GGGRNNYYCC），發(fā)揮轉錄因子的作用,促進基因的轉錄[4]。轉錄結束后，NF-kB與新合成的IκB結合出核并再次失活。外源激活刺激包括：前炎細胞因子（IL-1β,TNF-α,IL-11,IL-17）、脂多糖，蛋白激酶C、氧化劑、各種病毒及某些理化因素等。NF-κB激活后，快速誘導包括免疫反應和炎癥反應在內的多基因表達,主要包括細胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-11、IL-17)，化學因子（IL-8等）,炎性酶（iNOs和iCOX-2）、黏附因子（ICAM-1,VCAM-1），生長因子(VEGF)，凋亡相關因子p53和某些受體。既然NF-kB可以調節(jié)IL-1β和TNF-α表達，也可被它轉錄激活，在某些細胞中隨著NF-κB的慢性激活，可導致前饋性擴增。NF-κB不只是單獨作用，而是跟其他轉錄因子如：AP-1、ATF和C/EBP共同作用，擴大基因表達。
靶向性破壞NF-κB的組成元件，在其轉錄過程中發(fā)揮重要作用，敲除RelA的大鼠不能存活，敲除p50的基因導致對感染的易感，破壞IkB導致延長NF-κB的激活、感染的刺激，動物由于廣泛感染而死亡。如果抑制NF-κB的活動，可以減輕免疫反應和炎性介質的釋放，激素、阿司匹林和金制劑都是它的抑制劑，已廣泛應用于臨床。拮抗p65的反義寡核苷酸已用于試驗和臨床研究中。它能抑制大多數(shù)炎細胞因子的表達，減輕炎癥反應，減輕組織破壞。
三、骨性關節(jié)炎的細胞因子學說
近年來的研究表明，細胞因子和多肽生長因子不僅在關節(jié)軟骨和滑膜的正常結構和功能的維持方面起重要作用，而且，一些因子在關節(jié)炎的病理過程中對關節(jié)軟骨和關節(jié)滑膜也具有一定的破壞作用。在OA發(fā)生中最引人注目的是IL-1β、TNF-α兩種細胞因子，IL-1β 和TNF-α是關節(jié)炎病理過程中促進軟骨機制降解和關節(jié)軟骨破壞的兩種最重要的細胞因子。大量證據(jù)表明，IL-1b在關節(jié)炎的病理生理過程中發(fā)揮重要的作用，通過一系列反應，導致關節(jié)炎癥和軟骨的破壞[1、2]。在關節(jié)軟骨中，IL-1可阻止軟骨基質蛋白的形成 [3、4]，誘導軟骨細胞產生基質金屬蛋白酶[5]，介導金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）與金屬蛋白酶（MMPs）之間失衡，降解軟骨基質成分。還可誘導產生炎性介質，包括前列腺素（PGE）[6]和一氧化氮(NO)[7],導致關節(jié)的腫脹和疼痛。由誘導性一氧化氮合酶（iNOS）產生的一氧化氮(NO)在關節(jié)炎疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要的作用。而阻止一氧化氮的合成，可抑制一些關節(jié)炎的發(fā)生[8、9]。在關節(jié)中，NO主要有軟骨細胞和滑膜細胞產生[10]，對IL-1β和TNF-α等刺激敏感，這些刺激主要加快iNOS的表達和合成，以增加NO的產量[12、13]，iNOS蛋白的合成調節(jié)主要在轉錄水平，主要包括NF-kB和AP-1[13-18]。但A. Ferreira Mendes等[19]認為，NF-κB和p38是主要的兩條相互獨立的誘導iNOS表達的轉錄通路，阻止其中的任何一條，都足以阻止iNOS的表達，減少關節(jié)軟骨細胞內NO的含量。而前列腺素的增加與COX-2活化有關，主要與NF-κB調節(jié)有關，而干擾其活性可顯著降低COX-2的表達，進一步降低前列腺素的合成[20]。在軟骨組織中，TNF-α選擇性地抑制Ⅱ型和Ⅸ型軟骨膠原的產生，抑制蛋白多糖的合成，同時促其降解，另外，對PA、PGE2、和IL-6均有誘導作用，與OA軟骨破壞及滑膜炎有關。OA軟骨與正常軟骨相比，產生更多的TNF-α和TNF-α轉換酶（TNF-alpha convertase enzyme，TACE）mRNA，TACE是TNF-α的活性調節(jié)劑。從OA關節(jié)軟骨中分離的軟骨細胞中p55 TNF 受體(TNF-R)高表達。在神經細胞中，抑制NF-κBp50可抑制p53和NO的表達，可抑制神經細胞的凋亡。有作者認為，TNF-α是IL-1β的上游因子，可誘導IL-1β的產生并共同作用，在骨性關節(jié)炎的早期發(fā)揮作用。
小結
骨性關節(jié)炎的主要致病因素使IL-1β和TNF-α,二者都可通過NF-κB轉錄因子介導的通路激活MMPs,iNOS和COX-2,引起軟骨損傷和關節(jié)炎癥狀。而且還進一步反饋增加IL-1β和TNF-α的轉錄表達。因此應用特異性的siRNA阻抑p65蛋白的表達，從而降低NF-κB的轉錄表達活性，抑制上述炎性介質的表達，達到治療骨性關節(jié)炎的目的。同時在軟骨細胞中對NF-kB與p53的凋亡作用也進行初步的研究，為下一步的工作創(chuàng)造條件。
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