作者：張國英 楊慧 劉明社 張蕓 趙中夫

【關(guān)鍵詞】  陽離子脂質(zhì)體META;HepG2細(xì)胞;RNA干擾;AFP

    摘 要  目的:篩選較理想的陽離子脂質(zhì)體META/pGenesil-AFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2的方法。方法:將針對兩條靶序列AFP1和AFP2的shRNA的DNA模板雙鏈，連接于質(zhì)粒表達(dá)載體，構(gòu)建質(zhì)粒載體pGenesil-1-AFP1（含綠色熒光蛋白GEP編碼序列）及pGenesil-2-AFP2，用陽離子脂質(zhì)體META/質(zhì)粒載體pGenesil-1-AFP1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察并計(jì)算不同劑量配比的脂質(zhì)體/質(zhì)粒載體混合液轉(zhuǎn)染效果及微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測不同劑量配比轉(zhuǎn)染后對AFP基因表達(dá)的影響。結(jié)果:劑量比為8μL∶2.5μg條件，能有效地轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，并有效抑制AFP表達(dá)且無細(xì)胞毒性作用。結(jié)論:本研究成功建立了陽離子脂質(zhì)體META/質(zhì)粒載體pGenesil-1-AFP1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法。

    關(guān)鍵詞  陽離子脂質(zhì)體META;HepG2細(xì)胞;RNA干擾;AFP

    近年來發(fā)現(xiàn)的RNA干擾技術(shù)（RNAi）被認(rèn)為是最有效基因敲除方法。實(shí)施siRNA對靶序列的抑制，成功地將雙鏈RNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。本研究將針對兩條靶序列AFP1和AFP2的shRNA的DNA模板雙鏈，連接于質(zhì)粒表達(dá)載體，構(gòu)建質(zhì)粒載體pGenesil-1-AFP1（含綠色熒光蛋白編碼序列）及pGenesil-2-AFP2，用陽離子脂質(zhì)體META/質(zhì)粒載體pGenesil-1-AFP1對HepG2細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究，擬篩選較理想的陽離子脂質(zhì)體META/pGenesil-1-AFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2的方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    高糖型DMEM培養(yǎng)基由美國GIBCO公司提供;胎牛血清由杭州四季青生物制品公司提供;L-谷氨酰胺由北京化學(xué)試劑公司提供;META-FECTENE 轉(zhuǎn)染試劑由德國BIONTEX提供;質(zhì)粒載體pGenesil-1-AFP1、pGenesil-2-AFP2由武漢晶賽生物工程有限公司協(xié)助合成;AFP化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒由美國BECKMEN提供;人肝癌細(xì)胞HepG2由北京大學(xué)感染科病毒研究室惠贈，本室傳代。

    1.2 方法

    1.2.1  目標(biāo)基因序列的選擇及載體構(gòu)建:以人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞AFP基因作為作用靶點(diǎn)（geneID:174），合成兩條AFP-shRNA，分別為 AFP-1，AFP-2，經(jīng)BLAST軟件查對及序列同源性分析，確定目標(biāo)基因序列為:AFP-1:1275i-GCATTG- GCAAAGCGAAGCT-，AFP-2:694i-GCAGCU-UGUUAAAUCAACA-陰性對照（HK）:-GACTTCATAAGGCGCATGC-，構(gòu)建質(zhì)粒載體pGe-nesil-1-AFP1插入的DNA模板序列（包含GFP編碼 序列）:5′- GATCCGCATTG-GCAAAGCGAAGCTTTCAAGACGAGCTTCGCTTT-GCCAATGCTTTTTTGTCGACA-3′ ，3′-GCGTAAC-CGTTTCGCTTCGAAAGTTCTGCTCGAAGCGAAAC GGTTACGAAAAAAC AGCTGTTCGA-5′，構(gòu)建質(zhì)粒載體pGenesil-2-AFP2插入的DNA模板序列為: 5′ - GATCCGGTCTTACA-TAAGAGGACTTTCAAGACGAGTCCTCTTATGT AA-GACCTTTTTTGTCGACA-3′，3′-GCCAGAATG-TATTCTCCTGAAAGTTCTGCTCAGGAGAATACATT CTGGAAAAAACAGCTGTTCGA-5′，構(gòu)建質(zhì)粒載體pGenesil-2-HK插入的DNA模板序列為:5′ -GATCCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACG-GCATGCGCCTTATGAAGTCTTTTTTGTCGACA-3′ ，3′-GCTGAAGTATTCCGCGTACGAAGTTCTGCC GTACGCGGAATACTTCAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5′，載體質(zhì)粒的構(gòu)建及酶切鑒定、DNA序列分析由武漢晶賽生物工程公司協(xié)助完成，濃度為2.5μg/μL。

    1.2.2  待轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)和準(zhǔn)備:HepG2細(xì)胞生長于含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基中，并在37℃、5%CO 2 孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化后吹打成單細(xì)胞懸液，以4×10 5 密度轉(zhuǎn)種于放置了無菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔2mL。24h后觀察細(xì)胞生長，鋪滿孔底面積約60%時(shí)用于轉(zhuǎn)染。

    1.2.3  轉(zhuǎn)染試劑META/質(zhì)粒載體混合液配制及轉(zhuǎn)染:劑量配比在其建議范圍（2∶1～7∶1）內(nèi)選擇設(shè)計(jì)，按META/pGenesil配比分六組，分別為空白對照組，3μL∶1μg組，6μL∶1μg組，8μL∶2.5μg組，12μL∶2.5μg組，15μL∶5μg組，每組設(shè)三個復(fù)孔。用 pGenesil-1-EGFP-AFP1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以便熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

    取10支無菌1.5mL EP管，作好標(biāo)記:取9μL，18μL，24μL，36μL，45μL脂質(zhì)體分別加入A1，A2，B1，B2，C1管中;迅速加入無抗生素?zé)o血清的 DMEM培養(yǎng)基，使得各管中總體積為300μL，輕輕混勻。a1，a2管中各加1.2μL pGenesil-1-EGFP-AFP1;b1，b2管中各加3μL;c1管中加6μL;然后各管中迅速加入無抗生素及血清的DMEM培養(yǎng)基，使得各管中總體積為300μL，混勻。將管A1、A2、B1、B2、C1中的脂質(zhì)體對應(yīng)加入a1、a2、b1、b2、c1管中，輕輕混勻。室溫下靜置20min。取出培養(yǎng)板將板中培養(yǎng)液棄去，用無血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)板兩次后，留出三孔作為空白對照，每孔加1mL無血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)基，其余各孔各加0.8mL。除空白對照外，每三孔加入相同劑量配比的META-pGene復(fù)合物各200μL，混勻。將培養(yǎng)板置于CO 2 孵箱中培養(yǎng)8h后，吸出孔中DMEM，每孔加入含10%胎牛血清的完全DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后吸出細(xì)胞培養(yǎng)上清液，將蓋玻片用PBS洗滌兩次后置于熒光顯微鏡下觀察，記錄不同劑量配比的轉(zhuǎn)染效果。

    1.2.4  細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AFP的檢測:轉(zhuǎn)染后24h，對各孔AFP進(jìn)行檢測。采用微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析法，美國BECKMEN公司試劑盒操作。

2 結(jié)果

    2.1 不同劑量配比的META/質(zhì)粒載體混合液轉(zhuǎn)染效果熒光顯微鏡下，我們觀察到不同劑量配比的陽離子脂質(zhì)體有不同的轉(zhuǎn)染效果，表達(dá)綠色熒光蛋白的為被轉(zhuǎn)染細(xì)胞。為了計(jì)算不同配比陽離子 META的轉(zhuǎn)染率，在不同配比的轉(zhuǎn)染組的蓋玻片上各選擇3個視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞的平均百分率。以此篩選RNAi實(shí)驗(yàn)的最適META/質(zhì)粒載體比例。見表1。表1 不同配比脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染率（略）在不同配比試劑的轉(zhuǎn)染組中，8μL∶2.5μg組和12μL∶2.5μg組轉(zhuǎn)染效率較高，且兩者之間無顯著性差異（P>0.05）;但顯著高于3μL∶1μg組和6μL∶1μg組（P<0.01）。因15μL∶5μg組多數(shù)細(xì)胞發(fā)生崩解呈碎片樣，無法觀察到轉(zhuǎn)染效果，未列入統(tǒng)計(jì)表中。

    2.2 不同劑量配比組轉(zhuǎn)染后對AFP基因表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染后24h，對各孔AFP進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染率相一致的抑制作用，3μL∶1μg組和6μL∶1μg組與不做轉(zhuǎn)染的空白對照組相比，AFP含量無顯著性變化。8μL∶2.5μg組與12μL∶2.5μg組的AFP含量無明顯差別（P>0.05），但均較空白對照組和低濃度組減少（P<0.01）。見表2。 表2 不同配比轉(zhuǎn)染組對AFP表達(dá)的影響（略）根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選用劑量配比為8μL∶2.5μg的META/質(zhì)粒載體混合液為最佳條件配比。

    3 討論

    哺乳動物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染有多種方法 ［1］ ，在早期siRNA研究中多應(yīng)用磷酸鈣共沉淀法，但此方法轉(zhuǎn)染效率低且對很多細(xì)胞株無效。以后有人利用陽離子脂質(zhì)體在水中可形成微小的帶正電的單層脂質(zhì)體，靠靜電作用結(jié)合到核酸分子的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，被俘獲的核酸分子就會被導(dǎo)入細(xì)胞原理，采用陽離子脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染研究，此方法雖操作簡便，轉(zhuǎn)染效率高，但易產(chǎn)生高水平細(xì)胞毒性 ［2］。近幾年出現(xiàn)的新一代脂質(zhì)體―多聚陽離子脂質(zhì)體，可以濃縮DNA，將DNA運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使其在細(xì)胞核內(nèi)釋放，而且細(xì)胞毒性低，穩(wěn)定性好，轉(zhuǎn)染效率高（可達(dá)磷酸鈣沉淀法的5倍～100倍）。本實(shí)驗(yàn)中，我們將編碼siAFP的DNA模板插入pGenesil-1質(zhì)粒載體，構(gòu)建出pGenesil-1- AFP。這種質(zhì)粒以pEGFP-C1改造獲得，用陽離子脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以表達(dá)綠色熒光蛋白。在熒光顯微鏡下可以直接觀察到轉(zhuǎn)染成功的陽性細(xì)胞發(fā)出明亮綠色熒光。通過計(jì)數(shù)視野中陽性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)可以計(jì)算出轉(zhuǎn)染率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量的轉(zhuǎn)染試劑能將不同濃度比例的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染試劑:質(zhì)粒載體為8μL∶2.5μg組與12μL∶2.5μg組的轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率最高，均可達(dá)到50%左右，兩組轉(zhuǎn)染效率無顯著差異，但后者細(xì)胞活性明顯下降，而增加轉(zhuǎn)染試劑濃度比值至15μL∶5μg組中的細(xì)胞則發(fā)生溶解，說明多聚陽離子脂質(zhì)體劑量過大也可能對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。提示劑量比為 8μL∶2.5μg條件，能有效地轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，且無細(xì)胞毒性作用。(論文下載網(wǎng) www.lunwenda.com )

    甲胎球蛋白（AFP）是人類發(fā)現(xiàn)的第一個真正有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物，長期以來，一直認(rèn)為AFP僅可用于原發(fā)性肝癌（HCC）的診斷。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)及細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的發(fā)展，有關(guān)學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)AFP有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的重要生物學(xué)作用 ［3，4］ 。RNAi能高效、特異、持久抑制基因表達(dá)，對由于基因表達(dá)異常增高引起的疾病中有重要的應(yīng)用前景。先前應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制有關(guān)基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，大多采用體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA或構(gòu)建siRNA表達(dá)載體與靶基因表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞的方法，單獨(dú)觀察靶基因表達(dá)受抑效果，這種方法雖可以準(zhǔn)確檢測到siRNA特異地抑制基因表達(dá)作用 ［2，5，6］ 。但目前的轉(zhuǎn)染方法并不能保證試驗(yàn)體系中所有細(xì)胞均被轉(zhuǎn)染，不符合活體內(nèi)發(fā)生腫瘤的自然狀態(tài)。因此，試驗(yàn)結(jié)果距應(yīng)用研究還有一定差距。本研究以HepG2細(xì)胞為研究對象，使轉(zhuǎn)染和未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在同一體系中培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)染效率達(dá)50%左右后，不去除未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，觀察AFP基因表達(dá)抑制情況。這種試驗(yàn)方案不僅比較接近機(jī)體發(fā)生腫瘤的自然狀態(tài)，而且可以更好地評價(jià)siRNA特異地抑制AFP基因表達(dá)的作用。

    參考文獻(xiàn)

    ［1］ Shlomai A，Shaul Y.Inhibition of hepatitis B virus expression and replication by RNA interference［J］.Hepatology，2003，37（4）:764～ 770.

    ［2］ Giladi H，Ketzinel-Gilad M，Rivkin L，et al.Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice［J］.Molecular Thera-py，2003，8（5）:769～776.

    ［3］ Li MS，Li PF，He SPet al.Promoting molecular mechanism of alpha-fetoprotein on the growth of human hepatoma Bel7402line cellsJ］.World Gastrunal，2002，8（3）:467～472.

    ［4］ 康曉燕，殷正豐，錢海華，等.肝癌患者外周血甲胎蛋白異質(zhì)體和轉(zhuǎn)錄物含量的相關(guān)分析［J］.中華肝臟病雜志，2003，11（1）:17～19.

    ［5］ Novina CD，Murray MF，Dykxhoorn DM，et al.siRNA-direct-ed inhibition of HIV-1infection［J］.Nat Med，2002，8（7）:681～686.［6］ Jacque JM，Triques L，Stevenson M.Modulation of HIV-1replication by RNA interference［J］.Nature，2002，418:435～438

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